葉筱燕，蒙秉新，張燕，蘇建英，丁艷，王玉文，王遠(yuǎn)志

（1.海南省人民醫(yī)院皮膚科，海南 ?？?570102；2.海南省婦女兒童醫(yī)院皮膚科，海南 海口 570206）

盤(pán)狀紅斑狼瘡患者T淋巴細(xì)胞CD70基因的表達(dá)及臨床意義

葉筱燕1，蒙秉新1，張燕1，蘇建英1，丁艷2，王玉文1，王遠(yuǎn)志1

（1.海南省人民醫(yī)院皮膚科，海南 ?？?570102；2.海南省婦女兒童醫(yī)院皮膚科，海南 ?？?570206）

目的 檢測(cè)盤(pán)狀紅斑狼瘡(DLE)患者外周T淋巴細(xì)胞CD70基因表達(dá)水平，并探討CD70基因在DLE發(fā)病機(jī)理中的作用。方法RT-PCR測(cè)定2014年1月至2015年6月在我院就診的15例活動(dòng)期、15例非活動(dòng)期DLE患者和同期健康體檢的15例健康人(對(duì)照組)外周血T淋巴細(xì)胞CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組樣本中CD4+CD70+T/CD8+CD70+T的陽(yáng)性率。結(jié)果活動(dòng)期和非活動(dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞中的CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別為(4.5±0.19)和(2.9±0.09)，顯著高于對(duì)照組的(1.9±0.11)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且活動(dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞中的CD70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于非活動(dòng)期DLE患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；活動(dòng)期和非活動(dòng)期DLE患者的外周血CD4+CD70+T淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性率分別為(18.82±1.22)%和(15.32±1.01)%，明顯高于對(duì)照組的(14.63±0.41)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，且活動(dòng)期DLE患者的陽(yáng)性率顯著高于非活動(dòng)期DLE患者，統(tǒng)計(jì)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；活動(dòng)期和非活動(dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞中CD8+CD70+的陽(yáng)性率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論CD70基因的過(guò)度表達(dá)在DLE的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，且CD70過(guò)度表達(dá)可作為檢測(cè)DLE疾病患者的一個(gè)重要指標(biāo)。

盤(pán)狀紅斑狼瘡；T淋巴細(xì)胞；CD70基因；臨床意義

紅斑狼瘡(Lupus erythematosus，LE)是一種病譜性疾病，其有兩種亞型，分別為盤(pán)狀紅斑狼瘡(Discoid lupus erythematosus，DLE)以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)。DLE與SLE有許多相同的臨床表現(xiàn)，但是DLE普遍僅局限于皮膚，極少出現(xiàn)嚴(yán)重累及內(nèi)臟器官的情況，而SLE患者經(jīng)常累及心血管、腎臟、肺或中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[1]。目前對(duì)于DLE發(fā)病的基礎(chǔ)研究不夠充分，其具體機(jī)制尚不明確，臨床上至今仍缺乏有效的治療方法。

CD70是腫瘤壞死因子家族重要的成員[2]，是CD27的配體，普遍表達(dá)于活躍的CD4+和CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞上?，F(xiàn)普遍認(rèn)為CD70基因亦是狼瘡相關(guān)甲基化敏感基因[3-4]，CD27-CD70系統(tǒng)的紊亂導(dǎo)致一系列的免疫異常，據(jù)研究證實(shí)，CD27抗原是DLE疾病活動(dòng)的一個(gè)重要標(biāo)志，與疾病活動(dòng)密切相關(guān)[5]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于這一方面的研究還很薄弱。本文通過(guò)研究活動(dòng)期和非活動(dòng)期DLE患者外周血T淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+細(xì)胞中的CD70基因的分子表達(dá)水平，初步探討DLE的發(fā)病與CD70基因表達(dá)之間的關(guān)系，以期為進(jìn)一步明確DLE在基因及分子水平的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年6月在我院住院及門(mén)診就診的30例DLE患者，均符合DLE診斷標(biāo)準(zhǔn)的四項(xiàng)指標(biāo)。其中活動(dòng)期DLE 15例，女性13例，男性2例，平均年齡(26.8±5.7)歲；非活動(dòng)期DLE 15例，男性1例，女性14例，平均年齡(25.5±6.2)歲；對(duì)照組15例，皆為本院體檢中心健康體檢者，家族中無(wú)自身免疫性疾病史，女性14例，男性1例，平均年齡(27.5±5.3)歲。各組受檢者的性別和年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 試劑及其儀器 CD70：5'-TGCTTTGGTCCC ATTGGTCG-3'，5'-TCCTGCTGAGGTCCTGTGTGAT TC-3'(上海博亞生物技術(shù)有限公司)。QPCR反應(yīng)儀為ABI 7500(ABI公司)；Real Time反應(yīng)試劑盒(OMEGA公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Sigma公司)；總蛋白提取試劑盒(BestBio公司)；免疫磁珠(德國(guó)MiltenyiBiotec公司)；TRIZOL?試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Pmmega公司)；抗人CD4/CD8單克隆抗體BD (美國(guó)BD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 淋巴細(xì)胞細(xì)胞分離及其核酸抽提 各組樣本中取靜脈血30 mL(肝素抗凝)。采用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離方法分離外周血單核細(xì)胞。按說(shuō)明書(shū)操作用免疫磁珠分離T淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+細(xì)胞。用TRIZOL試劑按操作說(shuō)明操作提取總RNA以及基因組DNA，檢測(cè)濃度及純度后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)時(shí)PCR及Western blot檢測(cè)CD70的表達(dá) 任取樣本中所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板。以l/2×、1/4×、1/8×、1/16×、1/32×對(duì)倍稀釋成五個(gè)梯度后作為模版DNA，并以CD70基因與β-肌動(dòng)蛋白基因(內(nèi)參照基因)的特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，2個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件如下：50℃15 min，1個(gè)循環(huán)；95℃15 min，1個(gè)循環(huán)；94℃15 s，55℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃30 s；內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白：5'-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3'，5'-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3'。提取CD4+CD70+T淋巴細(xì)胞總蛋白，確定蛋白樣品的濃度后加入等量樣品到每個(gè)加樣孔，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，經(jīng)曝光、顯影及定影后，統(tǒng)計(jì)目的條帶灰度值。

1.3.4 流式檢測(cè)T淋巴細(xì)胞中CD70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)純度約為90%。從各組標(biāo)本中分別取50 μL T淋巴細(xì)胞懸液于試管中，細(xì)胞濃度為l×106個(gè)細(xì)胞/mL，待2次洗滌后先固定細(xì)胞再加入已用FITC標(biāo)記過(guò)的抗人CD70抗體，以及PE標(biāo)記過(guò)的抗人CD4/CD8單克隆抗體，室溫下標(biāo)記時(shí)間為30 min，經(jīng)洗滌后每管中加入用含0.5%甲醛的磷酸鹽緩沖液，輕輕吹打混勻制成細(xì)胞懸液，然后以細(xì)胞測(cè)定數(shù)為5 000個(gè)左右的濃度上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算出每份標(biāo)本中CD4+CD70+細(xì)胞及CD8+CD70+細(xì)胞占T淋巴細(xì)胞的百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組受檢者的CD70 mRNA表達(dá)水平比較如圖1所示，與對(duì)照組比較，活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且活動(dòng)期DLE患者的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于非活動(dòng)期患者，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)?；顒?dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者中T淋巴細(xì)胞CD4+細(xì)胞的CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。活動(dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞CD4+細(xì)胞的CD70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于非活動(dòng)期DLE患者中的轉(zhuǎn)錄水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者中T淋巴細(xì)胞CD8+的CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 DLE患者與對(duì)照組T淋巴細(xì)胞中CD70 mRNA的水平比較

表1 DLE患者T淋巴細(xì)胞中CD70 mRNA的表達(dá)(±s)

表1 DLE患者T淋巴細(xì)胞中CD70 mRNA的表達(dá)(±s)

注：與對(duì)照組比較；aP＜0.01；與非活動(dòng)期比較，bP＜0.05。

臨床特征CD70 mRNA水平(ΔCt值)t/F值P值年齡(歲)≤25＞25性別t=1.520.14 12.50±0.92 12.26±0.87 t=0.260.88男女12.34±0.90 12.36±0.91 CD4+對(duì)照組非活動(dòng)期活動(dòng)期CD8+對(duì)照組非活動(dòng)期活動(dòng)期F=5.65＜0.01 13.53±0.93 12.08±0.71a11.24±0.62abF=1.310.28 12.29±0.90 12.47±0.97 12.97±0.06

2.2 三組受檢者T淋巴細(xì)胞中CD70水平比較 活動(dòng)期和非活動(dòng)期DLE患者的外周血CD4+CD70+T淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性率分別為(18.82±1.22)%和(15.32±1.01)%，明顯高于對(duì)照組的(14.63±0.41)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，且活動(dòng)期DLE患者的陽(yáng)性率顯著高于非活動(dòng)期DLE患者，統(tǒng)計(jì)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；活動(dòng)期和非活動(dòng)期DLE患者T淋巴細(xì)胞中CD8+CD70+的陽(yáng)性率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 流式檢測(cè)DLE患者與對(duì)照組中T淋巴細(xì)胞中CD70水平比較

2.3 CD4+CD70+T淋巴細(xì)胞CD70蛋白的Western blot檢測(cè) 與對(duì)照組比較，活動(dòng)期、非活動(dòng)期DLE患者CD4+T淋巴細(xì)胞的CD70基因平均表達(dá)水平均提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；活動(dòng)期DLE患者中CD70基因的平均表達(dá)水平明顯高于非活動(dòng)期DLE患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)CD4+CD70+T淋巴細(xì)胞CD70蛋白水平

3 討論

CD70是編碼腫瘤壞死因子的基因之一，主要在T細(xì)胞和B細(xì)胞上表達(dá)，其配體是CD27分子[6]。體外實(shí)驗(yàn)的條件下處于未活化T淋巴細(xì)胞中CD70基因是很少表達(dá)的，但是處于變態(tài)反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)等條件下，T淋巴細(xì)胞經(jīng)刺激活化后可大量表達(dá)CD70蛋白[7]。作為T(mén)淋巴細(xì)胞的輔助/共刺激信號(hào)，CD70與CD27的結(jié)合可以對(duì)B細(xì)胞的激活進(jìn)行調(diào)控[8]。

CD27-CD70的系統(tǒng)紊亂可引起機(jī)體的一系列免疫異常，CD27可以促進(jìn)人B細(xì)胞分泌產(chǎn)生免疫球蛋白，且與漿細(xì)胞的分化增強(qiáng)有關(guān)[9]；CD70與CD27的結(jié)合可引起協(xié)同刺激信號(hào)促進(jìn)B細(xì)胞分泌IgG抗體，使得狼瘡患者外周血中B淋巴細(xì)胞的異常表達(dá)以及促進(jìn)產(chǎn)生依賴(lài)T細(xì)胞分泌的IgG[10-11]。因此CD70在B細(xì)胞異?；钴S中的作用，可能與LE等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。El-Mahdy等[12]研究表明，CD4+T經(jīng)過(guò)甲基化抑制劑處理后，細(xì)胞會(huì)過(guò)度表達(dá)CD70，且過(guò)度表達(dá)的CD70又將刺激B細(xì)胞分泌IgG，并且抗CD70抗體阻斷能阻斷這種異常分泌，這些均為T(mén)細(xì)胞過(guò)度表達(dá)CD70蛋白進(jìn)而有利于促進(jìn)IgG分泌增加的假說(shuō)提供了必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，活動(dòng)期和非活動(dòng)期DLE患者中外周血T淋巴細(xì)胞CD4+細(xì)胞內(nèi)CD70基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平均明顯升高，但CD70基因并未在CD8+T淋巴細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明CD70確實(shí)在DLE的發(fā)病機(jī)和發(fā)展過(guò)程中存在差異表達(dá)的現(xiàn)象。本研究還發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞中CD4+CD70+的細(xì)胞陽(yáng)性率以及T淋巴細(xì)胞CD4+細(xì)胞內(nèi)CD70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與DLE疾病進(jìn)展活動(dòng)的程度表現(xiàn)出正相關(guān)的趨勢(shì)，因此T淋巴細(xì)胞中CD70分子轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的高低可能可以成為衡量DLE疾病活動(dòng)進(jìn)展程度的又一個(gè)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

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Expression of CD70 in T lymphocytes from patients with discoid lupus erythematosus and its clinical significance.

YE Xiao-yan1,MENG Bing-xin1,ZHANG Yan1,SU Jian-ying1,DING Yan2,WANG Yu-wen1,WANG Yuan-zhi1. 1.Department of Dermatology,Hainan General Hospital,Haikou 570102,Hainan,CHINA;2.Department of Dermatology, Maternal&Child Health Hospital of Hainan Province,Haikou 570206,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of CD70 in T lymphocytes of discoid lupus erythematosus (DLE)patients and the role of CD70 in DLE pathogenesis.MethodsBlood samples were obtained from 15 patients with active DLE,15 patients with unreactive DLE and 15 normal human controls from January 2014 to June 2015.Quantitative RT-PCR and flow cytometry were applied to detect the transcriptional level of CD70 mRNA and the positive rate of CD4+CD70+T/CD8+CD70+T cells respectively.ResultsThe levels of CD70 mRNA in T lymphocytes in active DLE(4.5±0.19)and non-active DLE group(2.9±0.09)were significantly higher than that in the normal control group (1.9±0.11)(P＜0.01).Moreover,the levels of CD70 mRNA in the active DLE group was significantly higher than that in non-active DLE group(P＜0.05).The positive rate of peripheral blood CD4+CD70+T cells in active DLE group [(18.82±1.22)%]and non-active DLE group[(15.32±1.01)%]were significantly higher than that in the normal control group[(14.63±0.41)%](P＜0.05,P＜0.01).The active DLE group showed higher positive rate than non-active DLE group (P＜0.01).However,there was no significant difference between the three groups in the positive rate of CD8+CD70+T cells(P＞0.05).ConclusionThis study shows that over-expression of CD70 plays a significant role in the pathogenesis of DLE and could be used as an important index of disease detection in patients with DLE.

Discoid lupus erythematosus;T lymphocytes;CD70 gene;Clinical significance

R593.24

A

1003—6350（2016）14—2243—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.14.003

2016-01-12)

海南省衛(wèi)生廳衛(wèi)生計(jì)生行業(yè)科研項(xiàng)目(編號(hào)：瓊衛(wèi)2013自籌-33)

王遠(yuǎn)志。E-mail：wangyuanzhi407@163.com