邸紅芹，王曉玲(綜述)，王 亮，張 輝(審校)

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050041；2.河北省唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 064000；3.河北省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 石家莊 050041；4.河北省胸科醫(yī)院辦公室，河北 石家莊 050041)

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·綜 述·

呼吸道病原體分子診斷技術(shù)研究進展

邸紅芹1，王曉玲2(綜述)，王 亮3，張 輝4*(審校)

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050041；2.河北省唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 064000；3.河北省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 石家莊 050041；4.河北省胸科醫(yī)院辦公室，河北 石家莊 050041)

呼吸道感染；病原體；分子生物學診斷技術(shù)

呼吸系統(tǒng)是人體各個系統(tǒng)中與外環(huán)境接觸最頻繁的系統(tǒng)之一，在一些較差環(huán)境中很容易導致呼吸道感染，呼吸道感染也是臨床上最常見的感染性疾病[1]。呼吸道感染性病原體來源多樣，包括病毒、細菌、衣原體和支原體等，并且傳播迅速，臨床表現(xiàn)相似，單從臨床表現(xiàn)很難區(qū)分感染病原體，易造成誤診、貽誤病情和抗生素濫用[2]。傳統(tǒng)的檢測方法有病原體分離培養(yǎng)法和免疫檢測法，由于其操作過程繁瑣、靈敏度低以及檢測時間較長，無法滿足快速診斷的要求。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，檢測病原體的方法也在不斷進步，為臨床呼吸系統(tǒng)疾病的診斷和治療提供了很大的幫助。現(xiàn)就呼吸道病原體的分子生物學檢測方法及研究進展綜述如下。

1 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)

PCR技術(shù)是近年來廣泛用于臨床病原體檢測的一種有效手段，是PE Cetrus公司于1985年開發(fā)的一種體外快速擴增目的片段的專利技術(shù)，該方法特異、靈敏、快速且可使某些不能分離培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的病原體得以鑒定[3-4]。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，多重和實時熒光定量技術(shù)不斷應用于呼吸道病毒的檢測，使病原體鑒定發(fā)展更快。多重PCR技術(shù)即在單一PCR體系中加入兩對以上特異性引物，能同時擴增多個靶基因片段，根據(jù)不同靶基因片段的大小判定結(jié)果，在一個反應體系中可同時鑒定多種病原體。該方法為定性檢測，但快速靈敏、操作簡單，適合于在臨床醫(yī)學領(lǐng)域廣泛應用。Mo等[5]納入50例臨床樣本，采用多重RT-PCR法和熒光定量PCR法快速篩查甲型H1N1流感病毒、新型甲型流感病毒和乙型流感病毒，2種方法檢測結(jié)果一致率為100%。靶序列富集多重PCR技術(shù)(Tem-PCR)，針對目的基因設計兩對特異的巢式引物，經(jīng)過富集、加標簽和擴增3個階段，能夠在同一體系中快速、特異和高通量地診斷多種呼吸道病原體。Hassoun等[6]采用Tem-PCR技術(shù)檢測22種常見呼吸道病毒及19種細菌，該實驗納入了200份咽喉拭子標本(冬季和夏季各100份)，冬季收集的標本中，單一病毒和細菌感染的標本分別為11份和34份，其中檢出率最高的有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、莫拉菌和冠狀病毒；夏季收集的標本中有37份樣本存在至少一種細菌感染，4份樣本存在多種病毒感染，其中檢出率最高的有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。

多重實時熒光定量PCR(MRT-PCR)技術(shù)為多重PCR與熒光定量PCR相結(jié)合，實現(xiàn)了單一體系中多種病原體的并行定量檢測，可用于病原體的快速初篩及預防醫(yī)學的健康人群體檢。向蕾等[7]根據(jù)4種呼吸道病毒(人腺病毒、人博卡病毒、人偏肺病毒及熱呼吸道合胞體病毒)的保守序列建立多重熒光PCR快速檢測體系，體系優(yōu)化后，檢測靈敏度為10 copies/μL，對臨床樣本檢測的特異度為100%，表明該體系可以快速準確地檢測這4種呼吸道病毒，且重復性良好，特異度高。王玉月等[8]探討MRT-PCR在9種常見呼吸道病原體檢測中的價值，該研究納入了204例臨床標本進行回顧性檢測，包括副流感病毒1、2、3 型，以及肺炎支原體、肺炎衣原體、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞體病毒。實驗結(jié)果顯示MRT-PCR的最低檢出限為103copies/mL，特異度達100%，無交叉反應，且檢測結(jié)果與其他試劑報告結(jié)果完全一致。表明MRT-PCR具有快速、準確、特異度高等特點，在呼吸道病原體檢測方面有重要價值。

2 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)基于DNA/RNA分子雜交原理，靶序列能與固定在不同材料上的寡核苷酸片段相配對，同時借助一定的熒光檢測系統(tǒng)檢測待測標記樣品的雜交信號，并通過計算機系統(tǒng)對交信號進行分析和處理，從而快速得出待測品的基因序列及表達的信息。芯片技術(shù)在各種病原體的高通量檢測及基因分型領(lǐng)域有廣泛的應用，主要包括傳統(tǒng)的固相芯片、液相芯片及微流控芯片。

2.1固相芯片 傳統(tǒng)的固相芯基于DNA/RNA雜交技術(shù)，根據(jù)病原體序列設計特異的寡核苷酸單鏈點樣于微陣列芯片上，提取待測樣本的核酸，經(jīng)體外擴增、探針標記和靶序列雜交3個步驟處理，最后根據(jù)熒光信號判定檢測結(jié)果。此外，根據(jù)通量的需求，固相芯片技術(shù)可與多種技術(shù)聯(lián)合建立快速、高通量和自動化的檢測平臺，如ArrayTubeTM(AT，Germany)系統(tǒng)是基于多重PCR技術(shù)而建立的一種新型的酶標記、低密度、低消耗的芯片[9]；FilmArray分子診斷平臺是集提取、擴增、產(chǎn)物處理及數(shù)據(jù)分析為一體的全自動檢測系統(tǒng)，且在1 h內(nèi)可完成檢測，該平臺已通過FDA認證，用于檢測15種呼吸系統(tǒng)病毒和幾種呼吸道病原菌[10]。最近，基于擴增子拯救PCR技術(shù)(Arm-PCR)的iCubate檢測系統(tǒng)已經(jīng)上市，該技術(shù)克服了多個靶點擴增條件不兼容，并創(chuàng)新性設計了一次性全封閉卡盒，以及配套的卡盒處理儀、閱讀儀及控制軟件。目前，該平臺已開發(fā)出包括呼吸道病原體V組(20種)、呼吸道病原體B組(9種)、流感病毒分型(8種)、醫(yī)院獲得性病原體(14種)、分枝菌屬(13種)及葡萄球菌(9種)等多重PCR檢測試劑盒。iCubate全自動多重微生物核酸檢測系統(tǒng)具有多重、自動、封閉、快速、隨機、靈敏等技術(shù)特點，適合應用于疾病預防控制機構(gòu)、出入境檢驗檢疫部門，用于開展病原體篩查、院內(nèi)感染監(jiān)測、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫工作、食品衛(wèi)生檢驗工作，還適用于遺傳病基因突變檢測、mRNA和miRNA表達圖譜研究、免疫組庫多樣性分析等諸多領(lǐng)域。

2.2液相懸浮芯片 液相芯片(懸浮陣列芯片)技術(shù)是一種以熒光編碼微球為核心，可以同時標記100種不同比例顏色配置的熒光微球，應用激光檢測和流式細胞儀實現(xiàn)高分辨率和自動化，具有高靈敏度、高通量和并行檢測等特點；在核酸研究方面，常用于單核苷酸多態(tài)性基因分型、遺傳疾病篩選、基因表達分析，以及微生物檢測分析，其代表技術(shù)為Luminex公司研制的xMAP技術(shù)[11]。目前，基于xMAP技術(shù)和Luminex儀器，開發(fā)了3種商業(yè)化診斷試劑盒：Luminex公司基于靶位特異性引物延伸技術(shù)研發(fā)的xTAG試劑盒，該試劑盒已獲FDA認證(為多種呼吸道病毒診斷試劑盒)；凱杰公司開發(fā)的與xTAG原理類似(靶位特異性延伸技術(shù))的ResPlex試劑盒；EraGene公司基于靶序列富集多重PCR技術(shù)開發(fā)出來的MultiCode-PLx RVP試劑盒[12-13]。這些試劑盒使用便捷且具有較高的靈敏度，但它們都是開放性平臺，易于產(chǎn)生污染，同時靶序列多重PCR擴增限制了單管反應檢測的病原數(shù)量[14]。

2.3微流控芯片 20世紀90年代，微全分析系統(tǒng)的出現(xiàn)，通過化學分析將設備微型化與集成化，最大限度地將分析實驗室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的芯片中，實現(xiàn)“芯片實驗室”的構(gòu)想。微流控分析芯片通過微機電加工技術(shù)將整個實驗室的功能，包括采樣、稀釋、加試劑、反應、分離、檢測等集成在幾平方厘米的微流控芯片上，且可多次使用，因而極大地減少了樣品和分析試劑的用量，降低了分析的成本，加快了分析的速度，具有廣泛的適用性。文小霞等[15]運用微流控芯片分析方鑒定多重細菌，細菌進樣、培養(yǎng)和鑒定都在芯片上實現(xiàn)，同時結(jié)合培養(yǎng)池陣列的空間分辨力以及菌種特異性顯色培養(yǎng)基的顏色分辨力實現(xiàn)多重細菌檢測；該實驗采用4種常見泌尿系統(tǒng)感染病原菌作為模擬測試對象，結(jié)果顯示該方法在15 h內(nèi)可完成細菌鑒定，檢測限可達10 cfu/mL；此外，臨床樣本分析表明，該方法可以實現(xiàn)4種細菌同步鑒定，與傳統(tǒng)方法相比符合率為 96.3%。這種微流控細菌鑒定方法簡便快速，有望發(fā)展成為細菌檢測的有力工具。

3 核酸恒溫擴增技術(shù)

核酸恒溫擴增技術(shù)是一種新型的體外核酸擴增技術(shù)，其擴增反應始終在一個溫度下進行，反應快速、操作簡便、檢測靈敏度高，在呼吸道病原體檢測方面環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依賴核酸序列等溫擴增(nuclear acid sequence-based amplification，NASBA)和森巴(simple amplification based assay，SAMBA)等恒溫擴增技術(shù)運用較為廣泛[16]。

LAMP技術(shù)是一種基于鏈置換酶擴增核酸等溫擴增技術(shù)，能特異、高效、快速地擴增DNA，適宜病原體的快速分子生物學診斷，該技術(shù)在2000年由Notomi等報道。羅思思等[17]基于LAMP技術(shù)建立了禽流感病毒H7亞型和N9亞型的快速檢測方法，結(jié)果顯示該體系在63 ℃反應1 h就能特異地檢測禽流感病毒H7亞型和N9亞型，對其他亞型禽流感均無擴增，且最低檢測限為10 copies/μL。劉毅等[18]選擇121例臨床疑似結(jié)核患者痰液標本，建立LAMP檢測體系并評價其檢測能力，其特異度為92.16%，靈敏度為87.14%。表明該方法能夠快速準確地檢測結(jié)核分枝桿菌，適于基層醫(yī)院結(jié)核病診斷的推廣和應用。NASBA是一項以核酸為模板并能實時觀測結(jié)果的快速等溫擴增技術(shù),由2條特別設計的寡核苷酸引物介導、3種酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H和T7 RNA聚合酶)催化，在2 h內(nèi)將模板RNA擴增109-12倍，擴增速率和靈敏度要高于常規(guī)PCR。楊海鷗等[19]建立了一種基于NASBA技術(shù)檢測呼吸道合胞病毒的新方法，其檢測靈敏度要顯著高于RT-PCR，至少比RT-PCR高出2個數(shù)量級；臨床樣本檢測表明該方法可特異地擴增呼吸道合胞病毒的目的片段，對其他病毒均無擴增；該方法克服目前實驗室病毒檢測方法的局限性，為呼吸道病毒的檢測提供快速有效的實驗室診斷方法。SAMBA是一種新型、快速檢測病毒載量的方法，該方法基于恒溫擴增和可視化紙片技術(shù)，能夠在1.5 h內(nèi)得出診斷結(jié)果，且只需要普通的檢測儀器，對實驗員的要求也不高，適用于臨床和社區(qū)門診的快速檢測。

4 高分辨率熔解曲線技術(shù)

高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)技術(shù)是基于飽和熒光染料結(jié)合的雙鏈DNA在溫度升高的過程中會形成不同形態(tài)熔解曲線而發(fā)明的一種新型分子診斷技術(shù)，該技術(shù)于2003年由美國Utah大學Wittwer實驗室首次提出[20]。由于其高靈敏度和分析速率，HRM技術(shù)在遺傳位點、疾病相關(guān)性及病原體檢測方面應用較廣。趙煥英等[21]運用聚合酶鏈反應-高分辨率熔解曲線(PCR-HRM)技術(shù)檢測患者下呼吸道分泌液中菌群種類，根據(jù)擴增得到的不同HRM圖型與經(jīng)過測序鑒定的菌株進行對比，結(jié)果顯示PCR-HRM技術(shù)能夠特異、快速區(qū)分下呼吸道中不同細菌16S V3區(qū)。有研究根據(jù)嗜肺軍團菌16S rRNA基因保守序列應用PCR-HRM法進行檢測鑒定，該方法最低檢出濃度為0.1 pg/μL，在117例患者樣本中檢測出3株嗜肺軍團菌，與基因測序法結(jié)果一致[22]?；贖RM技術(shù)原理，市場有一些相關(guān)的商品化試劑盒，如獲得歐盟體外診斷醫(yī)療設備認證的RespiFinder-SMART-22試劑盒[23]，能夠一次性檢測22種呼吸道病原體(18種病毒和4種細菌)，其體系中包含一份極具競爭力的內(nèi)部擴增控制，具有單一實時熒光定量PCR的靈敏度，且能在核酸提取后4 h出檢測結(jié)果。

5 測序技術(shù)

呼吸道病原體最精確的鑒定方法就是獲得該病原體的整個基因組信息。2005年454公司基于焦磷酸測序法推出了高通量基因組測序系統(tǒng)，其能夠在短時間內(nèi)多樣本、高通量地獲得基因組信息，被Nature雜志以里程碑事件報道。Bialasiewica等[24]運用Solexa平臺檢測4例臨床患者和1例健康對照咽拭子標本，48 h內(nèi)測出5.9×105條序列信息，其幾乎涵蓋所有病原體的核苷酸信息，同時該技術(shù)一直用于檢測未知病原體，如副流感病毒4的發(fā)現(xiàn)。然而大多數(shù)臨床實驗室對這項技術(shù)沒有足夠的認知，尤其是大量的測序數(shù)據(jù)需要有專業(yè)的生物信息學人員進行分析，目前還不能在一線臨床機構(gòu)進行推廣。當然，未來高通量測序技術(shù)將會是呼吸道病原體診斷發(fā)展的趨勢。

6 其他技術(shù)

變性高效液相色譜技術(shù)由Oefner等在1995年提出，即把接近DNA解鏈溫度條件下進行的離子對反向色譜分析，是一種新型核酸檢測分析技術(shù)，具有分辨率高、自動化、高通量和成本低等優(yōu)勢。陳茹等[25]建立多重PCR-變性高效液相色譜法快速檢測結(jié)核分枝桿菌復合群特異性IS6110和IS1081插入序列，其具有很高的特異度，檢測靈敏度達到每個反應102基因拷貝，該法臨床檢測可縮短至24 h之內(nèi)。反向斑點雜交技術(shù)是一種結(jié)合基因擴增和分子雜交的基因診斷技術(shù)，由Saiki等提出，其原理先將特異性探針固定于膜上，再將待測的DNA樣本(一般為特異性的PCR產(chǎn)物，并預先對PCR引物5′端進行生物素標記，使擴增產(chǎn)物相應的帶有生物素標記)與之雜交，探針與待測樣本DNA單鏈通過堿基互補配對的原則相結(jié)合，凡是與待測DNA樣本結(jié)合的探針均帶有生物素標記，加入親和素偶聯(lián)的酶后，通過酶底物結(jié)合進行顯色，進而判斷雜交結(jié)果。蔣莎莉等[26]利用反向斑點雜交技術(shù)檢測97例病理石蠟組織中結(jié)核分枝桿菌，與熒光定量PCR及抗酸染色相比，反向斑點雜交技術(shù)具有較高的靈敏度和陽性檢測率。質(zhì)譜分析技術(shù)能夠提供大量可靠地蛋白、核酸信息，越來越多地用于病原體分子診斷。質(zhì)譜分析技術(shù)能夠與各種色譜分析及其他診斷技術(shù)結(jié)合，可大大提高其靈敏度，如質(zhì)譜分析技術(shù)與納米技術(shù)相結(jié)合可以檢測痕量靶向病原體。生物傳感技術(shù)利用目標檢測物與生物感應原件之間相互作用產(chǎn)生響應信號，通過對信號的處理、分析實現(xiàn)目標物檢測。表面增強拉曼光譜術(shù)能夠從分子水平檢測吸附在金屬表面的物質(zhì)并提供物質(zhì)獨特的指紋振動峰，進行高特異度、高靈敏度和高精確性的檢測分析。

呼吸道病原體的快速診斷是臨床治療的關(guān)鍵，常規(guī)的細菌學檢測仍是重要的實驗室診斷“金標準”，但檢測的靈敏度有很大的缺陷，容易出現(xiàn)假陰性，且一些不易培養(yǎng)的病原體檢測步驟非常復雜。分子生物學技術(shù)是快速有效的檢測方法，具有很高的靈敏度和特異度，在呼吸道病原臨床診斷上具有良好的應用前景。總之，隨著病原體診斷技術(shù)研究的不斷深入，對于指導臨床規(guī)范用藥以及減少疾病傳播有著深遠意義。

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(本文編輯：劉斯靜)

2016-09-23；

2016-10-18

河北省醫(yī)學科學研究重點課題(20150147)

邸紅芹(1973-)，女，河北深澤人，河北省胸科醫(yī)院副主任檢驗師，醫(yī)學碩士，從事臨床檢驗學研究。

*通訊作者。E-mail：zhanghui_4081@sina.com

R517.6

A

1007-3205(2016)12-1485-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.12.032