張學梅，董 梅，趙 寧，劉 輝，毛軼楠，周鯤鵬

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院手術室，河北 石家莊 050051；3.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000)

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·論 著·

石家莊市210例先天性耳聾青少年耳聾基因檢測及分析

張學梅1，董 梅2，趙 寧1，劉 輝1，毛軼楠3，周鯤鵬1

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院手術室，河北 石家莊 050051；3.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000)

目的了解石家莊市先天性耳聾青少年遺傳性耳聾的發(fā)病情況。方法采用聚合酶鏈反應及限制性內切酶方法，對石家莊市5所特殊教育學校210例先天性耳聾青少年進行基因檢測。結果210例耳聾患者中共有82例攜帶易感突變基因，總突變率為39.05%。其中GJB2基因235delC純合突變23例(10.95%)，雜合突變20例(9.52%)；PDS基因IVS7-2A>G純合突變13例(6.19%)，雜合突變?yōu)?2例(10.48%)；線粒體12sRNA DNA A1555G陽性突變?yōu)?例(2.38%)。結論石家莊地區(qū)先天性耳聾青少年遺傳性耳聾的發(fā)病率較高，以GJB2基因235delC位點突變?yōu)橹?，其次為PDS基因IVS7-2A>G。部分聽力正常者也攜帶致聾易感基因。

耳聾；突變；線粒體

聽覺障礙是影響人類健康的主要疾病之一,根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新資料顯示，目前世界上約2.5億聽力障礙患者，我國聽力障礙患者已經超過2 700萬，并且有逐年增加的趨勢。在西方國家，每1 000例新生兒中就有1～2例嬰兒患有重度先天性感音神經性耳聾，5歲以前的發(fā)病率可增加至2.7/1 000～3.5/1 000，其中有2/3是由遺傳因素所致[1]。目前由于認知的局限性，對遺傳性耳聾的治療尚無有效的治療方法。對危險人群做到早篩查、早發(fā)現(xiàn)、早治療，并給予專業(yè)的咨詢管理是解決問題的關鍵。針對這一問題，石家莊市第一醫(yī)院對石家莊地區(qū)部分先天性耳聾青少年進行分子遺傳學篩查，結果顯示石家莊地區(qū)耳聾患者GJB2 235delc、PDSIVS7-2A>G和線粒體DNA 12sRNA A1555G突變率均較高?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年3月—2015年12月石家莊市5所聾啞學校共210例先天性耳聾青少年，排除其他遺傳性疾病。調查耳聾患者的基本信息、耳聾史、家族史、聾兒出生史、個人史(耳聾前傳染病、耳毒性藥物應用情況、頭部是否受外傷等)。進行全身及?？撇轶w。行純音測聽。向家長解釋聾病基因篩查的意義和目的，讓家長了解耳聾基因檢測的必要性，填寫知情同意書。經家長同意后收集每位患者的基本資料和血樣。210例耳聾患者男性110例，女性100例，年齡8～29歲，平均(14.5±5.7)歲，均為漢族。其中非綜合征性耳聾為207例，Waardenburg綜合征3例。均無腦膜炎、中耳炎、腮腺炎等病史，無母孕期異常和出生時乏氧及早產等病史，無智力障礙，聾前無明確頭部外傷史。

1.2DNA提取 所有入選人員均經肘靜脈抽取外周血5～6 mL，乙二胺四乙酸抗凝管保存，應用試劑盒提取DNA(山東三月三基因技術有限公司)，提取步驟和方法參照試劑盒提供的使用說明進行。取適量提取DNA用紫外分光光度計進行定量和純度檢測，其余于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3檢測方法 應用聚合酶鏈反應及限制性內切酶方法進行檢測。

1.3.1試劑 GJB2 235delc突變、PDSIVS7-2A>突變檢測試驗為：2×PCR反應液、陰性對照DNA、純合突變陽性對照DNA、雜合突變對照DNA、酶切鑒定試劑；線粒體DNA12sRNA A155G的酶切鑒定試劑為：HaeⅢ限制性內切酶緩沖液、HaeⅢ限制性內切酶，其他與GJB2突變檢測試劑相同(所有試劑均為山東三月三基因技術有限公司提供)。

1.3.2擴增體系配制 2×PCR反應液10 μL，水7 μL，分別加入對照DNA及待檢樣本DNA 3 μL，無模板對照加水3 μL，總反應體系20 μL。

1.3.3擴增條件 保溫42 ℃，5 min；94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；復性58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；30個循環(huán)；再延伸72 ℃，5 min；4 ℃保存。

1.3.4GJB2及PDS酶切體系配制 PCR擴增產物10 μL，酶切鑒定試劑10 μL，總量20 μL體系。酶切條件：37 ℃水浴15 min。線粒體酶切體系配制：PCR擴增產物10 μL，HaeⅢ限制性內切酶緩沖液2 μL，HaeⅢ限制性內切酶1 μL，水7 μL，總量20 μL體系。酶切條件：37 ℃水浴1 h。

1.3.5瓊脂糖凝膠電泳檢測 2%瓊脂糖凝膠，酶切產物上樣量為8 μL，以電場強度為85 V電壓，進行恒壓電泳，時間為45 min。通過凝膠電泳成像分析儀進行樣本PCR產物酶切后圖像掃描觀察結果。

GJB2 235delc純合突變：出現(xiàn)940 bp條帶，與陽性對照DNA酶切片段泳動距離一致；GJB2 235delc雜合突變：出現(xiàn)940 bp、580 bp和360 bp 3條帶，與雜合對照DNA酶切片段泳動距離一致；GJB2 235delc野生陰性：出現(xiàn)580 bp和360 bp 2條帶，與陰性對照組DNA酶切片段泳動一致。

PDSIVS7-2A>G純合突變：出現(xiàn)190 bp條帶，與陽性對照DNA酶切片段泳動距離一致；PDSIVS7-2A>G雜合突變：出現(xiàn)190 bp和240 bp 2個條帶，與雜合對照DNA酶切片段泳動距離一致；PDSIVS7-2A>G野生陰性：出現(xiàn)240 bp條帶，與陰性對照組DNA酶切片段泳動距離一致。

線粒體DNA A1555G陽性突變：出現(xiàn)91 bp條帶，與陽性對照DNA酶切片段泳動距離一致；線粒體DNA A1555G野生陰性：出現(xiàn)111 bp條帶，與陰性對照組DNA酶切片段泳動距離一致。

2 結 果

2.1聽力檢測結果 全部研究對象由專業(yè)人員進行純音測聽檢查，按世界衛(wèi)生組織(1980)國際標準，210例聽障患者均為雙側重度-極重度感音神經性耳聾(聽力損失均在70 dB以上)。24例聽力正常者聽閾均為25 dB以下。

2.2PCR擴增及限制性內切酶酶切結果 210例耳聾青少年檢測對象中共82例發(fā)生了基因突變，總突變率為39.05%。其中GJB2基因235delC雙等位基因純合突變23例(10.95%)，單等位基因雜合突變20例(9.52%)；PDS基因IVS7-2A>G雙等位基因純合突變13例(6.19%)，單等位基因雜合突變?yōu)?2例(10.48%)；線粒體DNA A1555G陽性突變?yōu)?例(突變率為2.38%)。210例患者中有2例為GJB2基因235delC及PDS基因IVS7-2A>G單等位基因復合雜合突變。

3 討 論

耳聾是一類發(fā)病率高、病因復雜、給患者和社會家庭帶來沉重負擔的疾病。耳聾的影響因素主要分為環(huán)境和遺傳因素。目前隨著環(huán)境因素導致的耳聾發(fā)病率的降低和對耳聾診斷水平的提高，已經確定60%的耳聾是由遺傳缺陷引起，遺傳因素是導致耳聾的首要因素[2-3]。遺傳性聾分為非綜合征性耳聾(non-syndromic hearing impairment，NSHI)和綜合征性耳聾(syndromic hearing impairment，SHI)。其中70%為NSHI，臨床表現(xiàn)為單純的感音神經性聾，除聽力受損外基本無其他異常；其余30%為SHI，臨床表現(xiàn)多樣，除聽力損失外，常伴有全身其他器官的病變。本研究210例耳聾患者中207例患者為單純耳聾患者，除耳聾外，無其他異常表現(xiàn)；還有3例為Waardenburg綜合征，除遺傳性耳聾外，同時伴有智障、眼距增寬和額部少量白發(fā)。

遺傳性NSHI根據(jù)遺傳特征可分為4種：常染色體隱性遺傳性耳聾、常染色顯性遺傳性耳聾、線粒體DNA相關遺傳性耳聾及X-連鎖相關性遺傳性耳聾。其中以常染色體隱性遺傳性耳聾最為常見，約占非綜合征遺傳性耳聾總發(fā)病率的80%，常染色體顯性遺傳約占20%，X-連鎖及線粒體DNA相關耳聾占1%～2%[4]。目前已確定GJB2基因突變占常染色體隱性遺傳性聾病例中的比例為34%～50%。GJB2突變位點多樣，且有明顯種族特異性[5]。研究已經發(fā)現(xiàn)233～235 delc突變是東亞地區(qū)最常見的突變。本研究結果顯示石家莊地區(qū)210例樣本中有43例為GJB2 235 delc突變，突變率為20.48%，與文獻報道國內其他地區(qū)發(fā)病率相當[6-10]。GJB2 235delc純合突變患者臨床表現(xiàn)為自幼極重度感音神經性耳聾，盡管認知能力、數(shù)學和閱讀能力的下降與耳聾無直接關聯(lián)，但是因為重度-極重度聽力障礙，這些患者學習言語、數(shù)學及閱讀的能力大大受到限制，如果不干預，多數(shù)患者會成為聾啞人，盡管單純教育性的干預可部分彌補因聽力障礙帶來的問題，但是從根本上解決這些問題只有盡早診斷、盡早植入人工耳蝸才能提高GJB2耳聾患者認知、閱讀、語言能力。因此，對于GJB2突變檢測陽性患者應盡早診斷、盡早干預、盡早植入人工耳蝸是治療的關鍵[11-12]。

PDS即SLC26A4基因，是另外一個最常見的引起NSHI的基因，可導致前庭導水管擴大及耳聾。在我國導致前庭導水管擴大或前庭導水管擴大伴Mondini畸形最常見的原因是PDS IVS7-2A>G突變，其次為PDS A2168G，C1229T突變。本研究結果顯示由PDSIVS7-2A>G突變占所有耳聾患者的比率為16.67%(35/210)，與國內其他地區(qū)相當[9,13-15]。對于這一類患者，早期診斷，通過告知患者避免感冒、頭部劇烈活動、頭外傷等情況可延緩耳聾的進展，發(fā)現(xiàn)聽力下降盡早佩帶助聽器，可幫助部分兒童獲得有效的聽力補償，如已發(fā)展成為重度感音性耳聾，盡早植入人工耳蝸可幫助其重獲聽覺功能、保持學習語言及言語交流的能力，達到聾而不啞。

線粒體突變也是導致耳聾的眾多原因之一，在線粒體DNA中可導致耳聾的突變主要是12SrRNA的A155G、C1494T、T1095C、961delC及A827G等，其中以A155G最為常見，常伴有其他位點聯(lián)合突變[14,16]。12SrRNA基因突變是氨基糖苷類抗生素誘導的感音神經性耳聾的熱點。本研究結果提示線粒體DNA12SrRNA的A155G占石家莊地區(qū)先天性青少年耳聾的比率為2.38%(15/210)。對于攜帶這一基因突變的患者，預防使用氨基糖甙類抗生素能有效避免耳聾事件發(fā)生。

本研究首次報道了石家莊地區(qū)遺傳性耳聾的發(fā)病情況，結果提示在石家莊地區(qū)引起耳聾的主要原因為GJB2突變，其次為PDS基因，線粒體突變也占小部分比例。以上數(shù)據(jù)可為該地區(qū)耳聾患者的診治提供依據(jù)，更重要的是通過對突變基因的篩查，對于攜帶耳聾基因的家庭先分析耳聾患者及其父母的基因型，再為后代作出耳聾患者的風險系數(shù)[5]，為患者家族內成員的婚育提供指導意見，結合婚前或產前檢查可以避免耳聾患兒出生，而且研究已經證實產前通過檢查胎兒DNA來對某些遺傳性耳聾進行產前診斷在技術上是可行的[17-19]。因此，在人群中(包括重點人群和普通人群)進行耳聾基因篩查是十分必要和迫切的，建立全國和地方遺傳性耳聾防治機構將是未來耳聾防治工作的關鍵。但本研究僅對最常見的3個基因3個位點進行檢測，數(shù)據(jù)上尚不全面，我們將在今后的研究中完善和補充其他常見耳聾基因及位點檢測，從而為遺傳性耳聾的診治提供新的資料。

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(本文編輯：許卓文)

2016-03-23；

2016-07-22

石家莊市科學技術研究與發(fā)展指導計劃(141462573)

張學梅(1978-)，女，湖北黃岡人，河北省石家莊市第一醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事耳鼻咽喉疾病診治研究。

R764.431

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1007-3205(2016)12-1448-03

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.12.021