練繼文

·實驗研究·

胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)治療2型糖尿病調(diào)整葡萄糖代謝的機(jī)理研究

練繼文

胃轉(zhuǎn)流術(shù)在2型糖尿病患者的臨床治療上取得了很好的效果,但是具體的機(jī)制目前仍然沒有研究透徹,因此很多學(xué)者根據(jù)患者的表現(xiàn)和機(jī)體表現(xiàn)對手術(shù)的機(jī)制提出了各自的看法。本研究旨在探討胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)治療2型糖尿病的機(jī)理,研究表明下丘腦瘦素敏感性是機(jī)體葡萄糖代謝平衡調(diào)控的重要因素。胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)后血糖降低發(fā)生在術(shù)后24 h,同時伴隨血清瘦素水平的下降,提示機(jī)制與瘦素的靶器官-下丘腦的瘦素敏感性有重要關(guān)聯(lián)。

胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)；2型糖尿??；瘦素

糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病,是由遺傳和環(huán)境因素的復(fù)合病因引起的臨床綜合征。雖然經(jīng)過了大量的研究,但糖尿病的發(fā)病機(jī)制仍然沒有完全闡明。糖尿病主要分為1型糖尿病和2型糖尿病。其中80%～90%是2型糖尿病。對于糖尿病的療法,主要還是藥物、飲食調(diào)節(jié)和運(yùn)動治療。然而對于不能有效控制飲食或是完全靠胰島素的患者上述療法并不能帶來理想的治療效果,此時,一種新型的療法——胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)為廣大患者帶來了福音。

胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)創(chuàng)始于國外,已經(jīng)有20年歷史。該手術(shù)目前被定位為是自人們認(rèn)識糖尿病以來最有治愈前景的新療法。手術(shù)的主要原理是控制飲食和減低患者對食物的吸收,手術(shù)過后糖尿病患者的血糖水平會大大降低,然而對于手術(shù)調(diào)節(jié)血糖的機(jī)制至今仍然不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料 ①Goto-Kakizaki(GK)2型糖尿病大鼠,鼠齡2～3個月。②正常Wistar大鼠,鼠齡2～3個月。③瘦素受體敲除Zucker Fatty (fa/fa)大鼠,鼠齡2～3個月。所有動物都選擇雄性,按下述實驗分組實施不同手術(shù)。應(yīng)用2%的isoflurane吸入麻醉。手術(shù)組實施傳統(tǒng)的胃空腸Roux-en-Y吻合術(shù),術(shù)后特別注意飲食及水電平衡,注意傷口護(hù)理,供流食10 d,后進(jìn)軟食。

1.1.1 實驗動物分組 GK糖尿病大鼠組(80只)。胃腸轉(zhuǎn)流手術(shù)組：實施胃腸Roux-en-Y轉(zhuǎn)流術(shù)。開腹手術(shù)組(sham)：僅切開腹壁進(jìn)入腹腔,不進(jìn)行胃腸Roux-en-Y轉(zhuǎn)流術(shù)。非手術(shù)動物組：同籠相同食物飼養(yǎng),不給予任何干預(yù)措施。正常Wistar大鼠組：80只,分組同上。瘦素受體敲除組：24只,分組同上。

1.2 實驗方法

1.2.1 應(yīng)用微導(dǎo)管泵技術(shù)特異性刺激下丘腦,觀察手術(shù)后外周葡萄糖代謝指標(biāo)的變化情況。

1.2.1.1 置管 應(yīng)用GK 2型糖尿病大鼠和正常Wistar大鼠,按以上分組。于胃轉(zhuǎn)流手術(shù)1周后,應(yīng)用ketamine(87mg/kg)和xylazine (11mg/kg) 腹腔注射麻醉。留置導(dǎo)管于第三腦室,以下是大鼠腦立體定位裝置數(shù)據(jù)(from bregma: anterior-posterior; +0.2mm,dorsal-ventral；9.0mm,medial-lateral; 0.0 directly on the midsagittal suture),置管3周后,開始實驗。

1.2.1.2 刺激試驗 動物禁食(自由飲水)48 h后,以上各組動物分兩組處理。吸入麻醉后,一組連續(xù)滴注葡萄糖,一組滴注生理鹽水對照。控制血糖在8mmol/L水平滴注過程4 h。相同的方法,按同樣滴速連續(xù)灌注瘦素(2.5～5.0 ng/ml)和2-DG(2-Deoxyglucose-阻斷葡萄糖代謝產(chǎn)生無葡萄糖代謝信號效應(yīng))(15 mM)。

1.2.1.3 觀察指標(biāo)和檢測方法 以上試驗每30分鐘取全血150ml觀察血糖濃度(葡萄糖儀),制備血清檢測血瘦素、胰島素,胰高血糖素水平、胰高血糖素樣多肽(GLP-1)、葡萄糖依賴的胰島素樣多肽(GIP)(RIA 放免法)糖化血紅蛋白、(RIA放免法)。相當(dāng)于進(jìn)行葡萄糖、胰島素和瘦素耐量試驗(敏感性分析)。同時檢測標(biāo)志肝糖異生、糖原分解的門戶酶：葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PEPCK的表達(dá)［1］。

1.2.2 胃轉(zhuǎn)流手術(shù)后下丘腦瘦素作用對機(jī)體葡萄糖代謝平衡調(diào)整作用觀察。

1.2.2.1 應(yīng)用GK 2型糖尿病大鼠和正常Wistar大鼠,按以上分組。①營養(yǎng)攝食行為學(xué)觀察。從術(shù)后第1天起各組動物改單籠飼養(yǎng),每日進(jìn)行大鼠的體重、攝食量測量。并觀測動物在禁食24 h后和腹腔注射2-DG(500mg/kg)后30 min、1、2 h的攝食量(觀察手術(shù)和非手術(shù)動物下丘腦調(diào)節(jié)功能的變化)。②實驗觀察和檢測方法。觀察手術(shù)后外周葡萄糖代謝的變化規(guī)律以及和相關(guān)調(diào)節(jié)因子下丘腦調(diào)節(jié)指標(biāo)及脂代謝的相關(guān)關(guān)系。術(shù)后每日測量動物的血糖水平；每3天取全血100ml(制備血清檢測血瘦素、胰島素、胰高血糖素水平、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、胰島素樣生長因子(IGF-1)葡萄糖依賴的胰島素樣多肽(GIP)(RIA 放免法)糖化血紅蛋白、氫化考的松、游離脂肪酸、甘油三脂水平(ELASA酶標(biāo)法)；術(shù)后2周或1、3、6個月進(jìn)行葡萄糖,胰島素和瘦素耐量試驗,動物禁食24 h,腹腔注射葡萄糖(2 g/kg)分別于禁食前、注射前、注射后15、30、60、120、180 min取全血100ml(測量血葡萄糖、胰島素和瘦素水平)。

觀察手術(shù)后葡萄糖代謝平衡調(diào)節(jié)的規(guī)律及其和全身葡萄糖調(diào)節(jié)因子的關(guān)系。于術(shù)后3 d、1、2周、1、3、6個月處死動物。分別取全血,各部位腦組織、肝、胰腺、胃、十二指腸、空腸組織、腹內(nèi)脂肪組織等,于-80℃冰箱保存。其中,下丘腦等組織做如下實驗觀察：①提取RNA和蛋白質(zhì),RNA轉(zhuǎn)cDNA,觀察基因、蛋白水平表達(dá)。觀察瘦素受體、胰島素受體、葡萄糖激酶、神經(jīng)葡萄糖通道1(GLUT1)、CtBP、Glycine Receptor,Nuclear Receptor等mRNA的表達(dá)(RT-PCR)和細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路中葡萄糖和瘦素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(未磷酸化的蛋白)JAK2、Sock3、PI3K、Stat3、PKC的蛋白表達(dá)水平,并將應(yīng)用相關(guān)顯著變化因子的拮抗劑進(jìn)行驗證。找出細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵點。進(jìn)行中樞機(jī)制探討。相關(guān)抗體國內(nèi)均可購買。②組織形態(tài)學(xué)觀察: 下丘腦組織切片做免疫組化共聚焦顯微鏡觀察瘦素受體、JAK2、Sock3、PI3K、STAT3、PKC 等的表達(dá)。由于肝臟胰島素受體敏感性,決定循環(huán)瘦素受體并決定外周瘦素的敏感性,本實驗將進(jìn)行肝臟胰島素受體檢測。肝臟、胰腺、肌肉組織和外周脂肪組織切片,做免疫組化共聚焦顯微鏡觀察胰島素受體的表達(dá),得出外周胰島素拮抗改善的證據(jù)。

1.2.2.2 最后將應(yīng)用瘦素受體敲除的大鼠實施胃腸轉(zhuǎn)流手術(shù)進(jìn)行上述實驗。預(yù)期手術(shù)不會改變該大鼠的糖尿病樣病理特征?？梢詮姆疵孀C實下丘腦瘦素的作用在調(diào)整糖代謝中的重要性。

1.2.3 腸道-下丘腦—術(shù)后降糖調(diào)節(jié)環(huán)路的機(jī)制研究。應(yīng)用術(shù)后2周～1個月的各組動物,提取胃、十二指腸、空腸黏膜和下丘腦組織的RNA(TRIzol法 Invitrogen)及蛋白質(zhì)溶解液Lysed buffer,包括20mm MOPS(pH 7.0),2 mM 乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA),5 mM 乙二胺四乙酸(EDTA),0.5% Triton X-100,5 (M Pepstatin A)。進(jìn)行基因和蛋白芯片分析。并根據(jù)情況進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析,以找到作用在下丘腦的特異性消化道信號。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察治療前后GLP-1、IGF-1水平變化情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)前,大鼠GLP-1水平為(0.13±0.02)ng/100ml,術(shù)后36周GLP-1水平增加至(2.46±0.41)ng/100ml,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。手術(shù)前,大鼠IGF-1水平為(571.25±59.31)ng/ml,術(shù)后36周IGF-1水平增加至(625.59±31.32)ng/ml,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 治療前后GLP-1和IGF-1激素水平比較(±s)

表1 治療前后GLP-1和IGF-1激素水平比較(±s)

注：與術(shù)前比較,P＜0.05

指標(biāo) 術(shù)前 術(shù)后36周GLP-1水平(ng/100ml) 0.13±0.02 2.46±0.41 IGF-1水平(ng/ml) 571.25±59.31 625.59±31.32

2.2 手術(shù)前GK大鼠血糖水平為(8.5±1.0)mmol/L,手術(shù)后36周為(5.0±1.0)mmol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 手術(shù)前GK大鼠瘦素水平為(0.60±0.05)μg/L,手術(shù)后36周為(0.40±0.05)μg/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

3.1 胃腸轉(zhuǎn)流手術(shù)前后下丘腦調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖代謝平衡的作用。本研究應(yīng)用微導(dǎo)管泵技術(shù)直接置管于手術(shù)和非手術(shù)大鼠的下丘腦,應(yīng)用葡萄糖、瘦素和葡萄糖代謝抑制劑(2-DG)作用于下丘腦,觀察比較兩組大鼠外周血糖代謝平衡指標(biāo)的不同變化,證明下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)變化是由胃腸手術(shù)特異引起。為手術(shù)降糖機(jī)制中的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)假說提供直接證據(jù)。

3.2 胃腸轉(zhuǎn)流手術(shù)后下丘腦的瘦素效應(yīng)和敏感性對葡萄糖代謝平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制研究。在確立下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)在手術(shù)降糖機(jī)制中作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步行胃腸轉(zhuǎn)流手術(shù)和非手術(shù)大鼠下丘腦的瘦素效應(yīng)和瘦素受體敏感性的觀察,并探討葡萄糖和瘦素細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)關(guān)鍵作用點的表達(dá)變化。

3.3 引發(fā)中樞改變的上消化道特異性信號及其傳導(dǎo)分析。為進(jìn)一步探明手術(shù)后腸道-下丘腦-降低血糖的特異性信號及其中樞作用機(jī)制,應(yīng)用蛋白質(zhì)譜分析,基因蛋白芯片等方法對手術(shù)及非手術(shù)胃、十二指腸、空腸黏膜和下丘腦營養(yǎng)調(diào)節(jié)中樞的基因和蛋白的改變進(jìn)行分析、篩選,鑒定出引發(fā)中樞改變的上消化道特異性信號及其作用機(jī)制,提供其對下丘腦作用的直接依據(jù)［2-4］。

目前人們進(jìn)行了以下兩方面的研究［5-7］：①血糖的中樞神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)。②機(jī)體的能量代謝和葡萄糖代謝平衡受下丘腦調(diào)控。包括：感受外周激素和相關(guān)營養(yǎng)信號(如瘦素、胰島素、葡萄糖、胃分泌的Ghrelin、近端結(jié)腸分泌的PYY等),調(diào)控機(jī)體的能量攝入和消耗也控制體內(nèi)葡萄糖代謝產(chǎn)物的產(chǎn)出,以維持能量平衡并維持血糖水平在一個狹窄的正常范圍。

［1］章勇,陳宗祐,朱江帆,等.胃轉(zhuǎn)流手術(shù)治療Ⅱ型糖尿病的實驗研究.中國臨床醫(yī)學(xué),2006,13(6):960-962.

［2］張新國,楊學(xué)軍.手術(shù)治療Ⅱ型糖尿病的突破性進(jìn)展.武警醫(yī)學(xué),2004,15(12):883-884.

［3］王瑜,王燕婷,王烈.胃轉(zhuǎn)流術(shù)對非肥胖型T2DM的治療作用.中國普通外科雜志,2008(17):1003-1006.

［4］陳偉杰,胡三元,張光永.胃大部分切除術(shù)對非肥胖II型糖尿病的治療作用.腹腔鏡外科雜志,2009,14(3):211-214.

［5］陸付耳,冷三華,屠慶年,等.黃連解毒湯與黃連素對2型糖尿病大鼠葡萄糖和脂質(zhì)代謝影響的比較研究.華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2002,31(6):662-665.

［6］文重遠(yuǎn),吳勇,李燕,等.2型糖尿病大鼠心肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4的變化及其對葡萄糖和脂肪酸代謝的影響.中華醫(yī)學(xué)雜志,2005(21):1460-1463.

［7］謝飛舟,施冬云,肖玲,等.2型糖尿病葡萄糖應(yīng)激與抗氧化代償?shù)淖兓?復(fù)旦學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2009,36(1):23-27.

Research of mechanism of gastrectomy bypass in the treatment of type 2 diabetes mellitus and glucose metabolism adjustment

LIAN Ji-wen.Guangzhou City Baiyun District Red Cross Hospital,Guangzhou 510545,China

Gastrectomy bypass provided excellent effect in clinical treatment for type 2 diabetes mellitus patients,while its specific mechanism was still in need of further research.Various opinions were presented by scholars,according to manifestations and vital signs in patients.This study is aimed at investigating mechanism of gastrectomy bypass in the treatment of type 2 diabetes mellitus,and its research showed sensibility of hypothalamic leptin as an important factor in balance glucose metabolism adjustment.Decreased blood glucose occurred in postoperative 24 h after gastrectomy bypass,along with reduced serum leptin level.These showed important correlation between mechanism and sensibility of hypothalamic leptin,as the target organ of leptin.

Gastrectomy bypass; Type 2 diabetes mellitus; Leptin

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.05.226

2015-08-26］

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金課題(項目編號：A2013564)

510545 廣州市白云區(qū)紅十字會醫(yī)院