劉　瑤，　賀興波，　舒　濤，　黃才斌

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

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miR-141表達異常對人肝癌細胞惡性生物學表型的影響*

劉瑤，賀興波，舒濤，黃才斌△

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

[摘要]目的： 研究微小RNA-141(miR-141)在人肝癌細胞和正常胎肝細胞中的表達，同時分析miR-141表達異常對人肝癌細胞惡性生物學表型的影響。方法: 分別提取人肝癌細胞SMMC-7721和正常肝細胞HL-7702的總RNA，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-141的表達。采用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法分別將miR-141 mimic轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞，將miR-141 inhibitor轉(zhuǎn)染HL-7702細胞；MTS試劑盒和BrdU-ELISA檢測細胞增殖能力，流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細胞周期和凋亡率的變化。Transwell實驗檢測miR-141表達變化對細胞體外遷移能力的影響。結(jié)果: miR-141在SMMC-7721細胞中的表達較HL-7702細胞明顯下降。與空白組、脂質(zhì)體組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染25 nmol/L miR-141 mimic的SMMC-7721細胞中，細胞增殖速度減慢，S期細胞比例降低，凋亡細胞比例上升，細胞體外遷移能力下降；轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-141 inhibitor的HL-7702細胞中，細胞增殖速度加快，S期細胞比例上升，凋亡細胞比例下降，細胞體外遷移能力增強。結(jié)論: miR-141在人肝癌細胞中表達下降，上調(diào)miR-141表達可抑制肝癌細胞體外增殖活性和遷移能力，影響細胞周期和凋亡。在肝癌發(fā)病進程中，miR-141可能扮演抑癌基因的角色。

[關(guān)鍵詞]微小RNA-141； 肝細胞癌； 細胞增殖； 細胞周期； 細胞凋亡

miRNA是一類長度在20～25個核苷酸(nucleotide，nt)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子 RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控超過1/3基因的表達，參與真核生物體內(nèi)細胞增殖、分化凋亡、癌癥等一系列生命活動[1]。miR-141隸屬于miR-200家族，目前已有研究表明miR-141在結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤中高表達[2-3]，但在胃癌組織中低表達[4-5]。肝細胞癌中miR-141的表達水平如何以及miR-141表達異常對肝癌細胞生物學活性的影響未見文獻報道。本實驗通過loss-of-function和gain-of-function技術(shù)分析miR-141表達改變對肝癌細胞增殖、細胞周期、凋亡和體外侵襲能力的影響。

材料和方法

1材料

人肝癌細胞株SMMC-7721和正常人肝細胞HL-7702由贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院臨床科研中心保存。miR-141和內(nèi)參照U6 snRNA 特異逆轉(zhuǎn)錄及real-time PCR引物、miR-141 mimic和miR-141 inhibitor 購自廣州市銳博生物科技有限公司；RNA 提取試劑TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTMRNAiMAX和SYBR Green qPCR Super Mix購自Invitrogen；1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；MTS試劑盒購自Promega；BrdU-ELISA試劑盒購自Roche。細胞周期和凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物發(fā)展技術(shù)有限公司；Transwell 小室購自Corning。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)和miR-141表達水平的檢測SMMC-7721細胞和HL-7702細胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素)中培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d傳代1次。TRIzol法提取細胞的總RNA。紫外分光光度法上機檢測RNA的濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄總RNA后在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增，使用U6作為內(nèi)參照。

2.2細胞分組和瞬時轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期細胞，待融合度為30%～50%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。SMMC-7721細胞分為空白(blank)組、脂質(zhì)體(Lipofectamine,Lipo)組、25 nmol/L miR-141 mimic組和陰性對照(negative control，NC)組；HL-7702細胞分為空白組、脂質(zhì)體組、50 nmol/L miR-141 inhibitor組和NC組。

2.3MTS實驗檢測細胞活力 分別用0.25%的胰蛋白酶消化并收集SMMC-7721細胞和HL-7702細胞，調(diào)整細胞濃度為1×108/L，取每孔100 μL接種至96孔板。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作同前所述。各組細胞分別在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h將對應96孔板換液并每孔加入100 μL 1640培養(yǎng)液及10 μL MTS。室溫、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h，酶標儀讀取490 nm處吸光度(A)值數(shù)據(jù)。

2.4BrdU 法檢測細胞增殖 分別用0.25%的胰蛋白酶消化并收集SMMC-7721細胞和HL-7702細胞，調(diào)整細胞濃度為1×108/L，取每孔100 μL接種至96孔板，每組6個復孔。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作同前所述。各組細胞在轉(zhuǎn)染后72 h每孔加入20 μL BrdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后按照BrdU-ELISA 試劑盒操作說明書進行，酶標儀讀取450 nm處吸光度(A)值數(shù)據(jù)，參照波長為690 nm。

2.5細胞周期和凋亡率分析分別用0.25%的胰蛋白酶消化并收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，調(diào)整細胞濃度為1×109/L。細胞周期分析時，制備的單細胞懸液用體積分數(shù)為70%的乙醇固定，4 ℃保存過夜，染色前用PBS洗去固定液； 加50 μL RNase A，37 ℃水浴30 min； 再加200 μL PI染色均勻，4 ℃避光30 min；上流式細胞儀檢測，記錄激發(fā)波長為488 nm處紅色熒光。細胞凋亡率分析時，加入200 μL的binding buffer懸浮細胞；再加5 μL Annexin V-FITC混勻，之后加5 μL PI混勻，室溫避光反應5～15 min；在1 h之內(nèi)上流式細胞儀檢測。

2.6Transwell實驗檢測細胞遷移能力Transwell小室外室加入0.6 mL 完全培養(yǎng)基，放入37 ℃培養(yǎng)箱平衡1 h以上。用0.25%的胰蛋白酶消化并收集各組細胞，用無血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×109/L；小室上室加入適量細胞懸液(每孔0.1 mL)；37 ℃培養(yǎng)24 h后取出小室，用PBS洗2遍，甲醇固定5 min。外室加入結(jié)晶紫(0.1%)染色，顯微鏡下觀察并計數(shù)多個視野下的細胞。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本資料的t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1SMMC-7721細胞和HL-7702 細胞中miR-141的表達水平

Real-time PCR結(jié)果顯示人肝癌細胞SMMC-7721中miR-141表達水平顯著低于正常人肝細胞HL-7702(P<0.05)，見圖1。

2miR-141對細胞活力的影響

用MTS比色法檢測SMMC-7721細胞和HL-7702細胞24～72 h的生長情況，發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細胞在miR-141 mimic轉(zhuǎn)染后各時點的吸光度值明顯低于空白組、脂質(zhì)體組和NC組(P<0.05)，72 h的細胞活力抑制率最明顯?？瞻捉M、脂質(zhì)體組和NC 組相比較，差異無統(tǒng)計學顯著性。HL-7702細胞在miR-141 inhibitor 轉(zhuǎn)染后各時點的吸光度值明顯高于空白組、脂質(zhì)體組和NC 組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染后48 h細胞活力明顯增加。空白組、脂質(zhì)體組和NC 組相比較，差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，見圖2。

Figure 1.The expression of miR-141 in SMMC-7721 cells and HL-7702 cells measured by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHL-7702．

圖1Real-time PCR檢測2株細胞中miR-141的表達

3BrdU-ELISA 法檢測miR-141對細胞增殖的影響

與空白組、脂質(zhì)體組和NC組相比，miR-141 mimic轉(zhuǎn)染能顯著抑制SMMC-7721細胞體外增殖速度(P<0.05)。與空白組、脂質(zhì)體組和NC 組相比，miR-141 inhibitor轉(zhuǎn)染能顯著加快HL-7702細胞體外增殖速度(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The viability of SMMC-7721 cells and HL-7702 cells measured by MTS assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic;#P<0.05vsinhibitor．

圖2MTS檢測miR-141表達變化對2株細胞活力的影響

Figure 3.The proliferation of SMMC-7721 cells and HL-7702 cells measured by BrdU-ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic;#P<0.05vsinhibitor．

圖3BrdU-ELISA檢測miR-141表達變化對2株細胞體外增殖能力的影響

4miR-141對細胞周期和凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與空白組、脂質(zhì)體組和NC組相比，SMMC-7721細胞在miR-141 mimic 轉(zhuǎn)染后72 h G0/G1、S和G2/M期細胞分布發(fā)生了改變，S期細胞比例下降，G1期細胞比例上升，細胞凋亡率上升。而HL-7702細胞在miR-141 inhibitor轉(zhuǎn)染后72 h,S期比例上升，G1期細胞比例下降，細胞凋亡率下降，見圖4、5。

Figure 4.The cell cycle of SMMC-7721 cells and HL-7702 cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic;#P<0.05vsinhibitor．

圖4流式細胞術(shù)檢測miR-141表達變化對2株細胞細胞周期的影響

5miR-141對細胞體外遷移能力的影響

SMMC-7721細胞在miR-141 mimic轉(zhuǎn)染后，體外遷移能力明顯下降，穿膜細胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖6。而HL-7702細胞在miR-141 inhibitor轉(zhuǎn)染后，體外遷移能力明顯增強，穿膜的細胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖7。

討論

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種嚴重威脅人類健康的疾病，死亡率居惡性腫瘤第3位，全世界每年新發(fā)肝癌患者近63萬，其中55%發(fā)生在我國[6]。大多數(shù)肝癌患者在發(fā)現(xiàn)癥狀時，已屆病程的中晚期階段，錯過了手術(shù)治療的最佳時機。過去人們對HCC的研究多集中在尋找腫瘤相關(guān)基因，分析基因突變后對肝癌惡性生物學表型及細胞信號通路的影響?，F(xiàn)已有學者分別從不同角度深入探討腫瘤的發(fā)病機制,比如：啟動子區(qū)域CpG島的甲基化/去甲基化導致的基因表達沉默/激活；泛素化、磷酸化等蛋白質(zhì)翻譯后化學修飾導致的蛋白功能活化/鈍化；miRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶mRNA表達等。

miRNA是一類短小的非編碼RNA，由較長的初級轉(zhuǎn)錄物分別經(jīng)核酸酶Drosha和Dicer的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后以相對低的穩(wěn)定性組裝進RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，通過堿基互補配對結(jié)合的方式識別靶mRNA。當miRNA 5’端第2位到第 8位核苷酸序列構(gòu)成的種子區(qū)域與靶mRNA 3’非翻譯區(qū)堿基完全互補時，miRNA發(fā)揮類似小干擾RNA的功能，引導RISC降解靶mRNA；如果不完全互補則阻遏靶mRNA的翻譯[7]。

Figure 5.The apoptotic rate of SMMC-7721 cells and HL-7702 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic;#P<0.05vsinhibitor．

圖5流式細胞術(shù)檢測miR-141表達變化對2株細胞凋亡的影響

目前發(fā)現(xiàn)人類基因組編碼近700個miRNA，約50%分布在易發(fā)生染色體斷裂、擴增及融合的腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域或脆性位點[8-9]。國內(nèi)外學者應用生物芯片技術(shù)，在多種腫瘤組織中篩選出表達異常的miRNA，并對其功能和作用靶點進行了一系列研究[10-11]。miR-200家族是近年來研究比較集中的熱點，miR-141作為其中的一員，在維持上皮細胞表型穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用，但當其表達失調(diào)時可促進細胞表型上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換并導致上皮來源腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[12-13]。已有文獻報道外周血中miR-141的高表達與結(jié)腸癌患者遠處轉(zhuǎn)移、預后不良相關(guān)[2]。Shinozaki等[4]的研究卻發(fā)現(xiàn)miR-141在胃癌組織和多種胃癌細胞中表達明顯減少。鑒于miR-141在消化系統(tǒng)腫瘤中表達的差異性，我們認為有必要對原發(fā)性肝細胞癌中miR-141的表達情況進行分析。

通過實時熒光定量PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)肝癌細胞株SMMC-7721中miR-141表達水平顯著低于正常人肝細胞HL-7702。這和我們前期檢測的臨床切除肝癌和癌旁組織石蠟切片中miR-141的表達情況一致，且miR-141表達下調(diào)的程度與肝細胞癌惡性程度、腫瘤分化程度以及AFP有關(guān)，miR-141的表達隨著臨床分期增加而下調(diào)，分化程度越差、AFP表達越高的肝細胞癌組織中的miR-141的表達越低。為了進一步從體外水平研究miR-141表達異常對肝癌細胞株生物學活性的影響，我們通過gain-of-function技術(shù)上調(diào)肝癌細胞、loss-of-function技術(shù)下調(diào)正常肝細胞中miR-141的表達，SMMC-7721細胞在轉(zhuǎn)染miR-141 mimic后各時點的增殖抑制率均顯著上升，細胞周期S期比例下降，G1期比例上升，凋亡率上升，細胞體外遷移能力明顯下降，穿膜細胞數(shù)明顯減少;HL-7702細胞在miR-141 inhibitor 轉(zhuǎn)染后各時點的增殖率均顯著上升，細胞周期S期比例上升，G1期比例下降，凋亡率下降，細胞體外遷移能力明顯增強，穿膜細胞數(shù)明顯增多。

Figure 6.The migration of SMMC-7721 cells detected by Trans-well assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic．

圖6Transwell檢測miR-141表達變化對SMMC-7721細胞體外遷移能力的影響

Figure 7.The migration of HL-7702 cells detected by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.#P<0.05vsinhibitor．

圖7Transwell檢測miR-141表達變化對HL-7702細胞體外遷移能力的影響

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Effect of abnormal expression of miR-141 on malignant biological behaviors of human hepatocarcinoma cells LIU Yao, HE Xing-bo, SHU Tao, HUANG Cai-bin

(TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalCollege,Ganzhou341000,China.E-mail:hcbgmu@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the expression of microRNA-141 (miR-141) in human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line SMMC-7721 and normal hepatocyte line HL-7702, and to analyze the effect of abnormal expression of miR-141 on the malignant biological behaviors of human hepatocarcinoma cells. METHODS: The RNA from SMMC-7721 cells and HL-7702 cells was extracted. SYBR Green real-time PCR was performed to detect the expression of miR-141. Synthetic miR-141 mimic and its negative control were transfected into the SMMC-7721 cells, and miR-141 inhibitor and its negative control were transfected into the HL-7702 cells by the method of Lipofectamine. After transfection, MTS assay and BrdU-ELISA were employed to evaluate the effect of miR-141 on the cell proliferation. Flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis. The changes of migration ability were investigated by Transwell invasion assay. RESULTS: The expression of miR-141 in the SMMC-7721 cells was significantly lower than that in the HL-7702 cells (P<0.05). Compared with blank group, Lipofectamine group and negative control group, the proliferation of the SMMC-7721 cells transfected with 25 nmol/L miR-141 mimic was significantly inhibited in a time-dependent manner (P<0.05). The percentages of G1phase cells and early apoptotic rate were significantly increased when miR-141 was up-regulated, but the migration ability was inhibited (P<0.05). Compared with blank group, Lipofectamine group and negative control group, the proliferation of HL-7702 cells transfected with 50 nmol/L miR-141 inhibitor was significantly increased in a time-dependent manner (P<0.05). When miR-141 was down-regulated, the percentages of G1phase cells and early apoptotic rate were significantly decreased， but the migration ability was enhanced (P<0.05). CONCLUSION: miR-141 is down-regulated in human hepatocarcinoma cell line. Up-regulation of miR-141 will not only inhibit cell proliferation and migration ability, but also affect the cell cycle and apoptosis of SMMC-7721 cells. miR-141 may function as a tumor suppressor gene during HCC development.

[KEY WORDS]MicroRNA-141; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation; Cell cycle; Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.004

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0797-8283981; E-mail: hcbgmu@163.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81160257); 江西省高校中青年教師發(fā)展計劃專項資金資助項目(贛財教指[2012]132號)

[收稿日期]2015- 07- 15[修回日期] 2015- 11- 24

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0215- 06