鄧 瑩，羅 雯

(南昌師范學(xué)院生物系，江西南昌 330032)

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意大利生菜組織培養(yǎng)體系的建立

鄧 瑩，羅 雯*

(南昌師范學(xué)院生物系，江西南昌 330032)

摘要[目的]建立意大利生菜組織培養(yǎng)體系。[方法]以意大利生菜(LactucasativaL. var.ramosaHort.)種子為試驗材料，用不同有效氯含量(0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%)的漂白水滅菌，于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌苗。取4~5 d苗齡的無菌幼苗子葉，在添加不同濃度激素的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，并進(jìn)一步誘導(dǎo)生芽、生根，篩選最佳誘導(dǎo)激素配比及激素濃度。[結(jié)果]意大利生菜種子經(jīng)有效氯含量1.0%的漂白水處理，于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)可獲得意大利生菜無菌苗。無菌幼苗子葉在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上，可以得到理想的意大利生菜愈傷組織；在MS+0.25 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上，最有利于意大利生菜愈傷組織不定芽的發(fā)生且對后期生根有良好的誘導(dǎo)作用。[結(jié)論]配合使用一定濃度的6-BA和NAA可有效建立意大利生菜組織培養(yǎng)再生體系，為進(jìn)一步建立意大利生菜遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞意大利生菜；子葉；組織培養(yǎng)

生菜屬于菊科Compostiae萵苣屬Lactuca,是一種含有多種營養(yǎng)元素，不經(jīng)加工即可食用的蔬菜[1]。同時，生菜組培再生率和轉(zhuǎn)化率均較高，可以作為一種良好的植物生物反應(yīng)器[2-3]。借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)，能將生菜開發(fā)成一種有利的功能性蔬菜[4]。轉(zhuǎn)基因生菜最早于1987年獲得，而建立高效的生菜轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化體系的前提條件是建立生菜組織培養(yǎng)再生體系[5]。筆者以生長周期更短的意大利生菜(LactucasativaL.var.ramosaHort.)，為試驗材料，對其愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽發(fā)生的最適激素配比進(jìn)行了篩選，建立意大利生菜組織培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步建立意大利生菜遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料意大利生菜種子廣西橫縣子龍種業(yè)有限公司。

1.2試劑藍(lán)月亮漂白水(有效氯含量4.0%)；植物生長調(diào)節(jié)激素6-BA、NAA(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)；MS培養(yǎng)基。

1.3方法

1.3.1無菌苗培養(yǎng)條件的篩選。將適量的意大利生菜種子用75%乙醇消毒30 s，無菌蒸餾水沖洗2次，每次3 min。將種子分別放入不同濃度的漂白水(有效氯含量分別為0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%)消毒15 min，再用無菌蒸餾水沖洗3次，每次3~4 min，瀝干水分后點(diǎn)種于MS培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照周期16 h/d，5 d后觀察種子萌發(fā)情況。

1.3.2愈傷組織誘導(dǎo)條件的篩選。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂及不同濃度配比的6-BA和NAA，pH 5.8，121 ℃滅菌30 min。6-BA濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L，NAA濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L。取苗齡5 d的生菜無菌苗，沿分生點(diǎn)處切取生菜的兩片子葉，分別接種于附加不同濃度激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，葉片正面朝上，保證切口與培養(yǎng)基充分接觸，于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照周期16 h/d，14 d后記錄愈傷組織形成情況并統(tǒng)計其誘導(dǎo)率。

1.3.3愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽的誘導(dǎo)條件篩選。挑選健康的愈傷組織從外植體上切下，轉(zhuǎn)移至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂及不同濃度配比的6-BA和NAA，pH 5.8，121 ℃滅菌30 min。6-BA濃度分別為0.15、0.25、0.35、0.45 mg/L，NAA濃度分別為0.10、0.15、0.20 mg/L。不定芽誘導(dǎo)在光照培養(yǎng)室中進(jìn)行，溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照周期16 h/d，14 d后統(tǒng)計不定芽數(shù)目和誘導(dǎo)率。

1.3.4再生苗生根培養(yǎng)。將長勢良好的再生芽接種于MS基本培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照周期16 h/d。6~12 d后觀察意大利生菜再生苗生根情況。

2結(jié)果與分析

2.1無菌苗培養(yǎng)條件由表1可知，意大利生菜種子萌發(fā)率隨著漂白水有效氯含量的升高先升高后降低。當(dāng)有效氯含量低于1.0%時，由于消毒不徹底，雜菌的污染也會抑制種子的萌發(fā)。當(dāng)有效氯含量高于1.0%時，有效氯含量越高對種子萌發(fā)的抑制作用越明顯。因此，使用有效氯含量為1.0%的漂白水處理種子，消毒效果良好且無雜菌生長，種子的萌發(fā)率最高(達(dá)10.7%)。

表1培養(yǎng)5 d后意大利生菜無菌苗生長情況

Table 1The growth of lettuce aseptic seedlings after 5 days of culture

漂白水(有效含氯量)Bleach(availablechlorine)∥%萌發(fā)率Seedlingrate∥%無菌苗Asepticseedlinggrowth雜菌Mixedbacteriagrowth012.8++++0.548.7+++1.070.7+++-2.060.7+-4.051.3+-

注 ：-無生長；+生長數(shù)量較少； ++生長數(shù)量中等 ；+++生長數(shù)量較多。

Note: -，+，++，+++ stand for no growth，small growth quantity，medium growth quantity and more growth quantity，respectively.

2.2愈傷組織誘導(dǎo)條件由表2可知，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L、NAA濃度為0.20 mg/L時，愈傷組織出愈率達(dá)100.0%，愈傷組織高等發(fā)生，無褐化和玻璃化現(xiàn)象，是愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。部分愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見圖1。

2.3愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)條件由表3可知，在所選濃度范圍內(nèi)，當(dāng)6-BA和NAA濃度較低時，對不定芽的發(fā)生影響不大，發(fā)生頻率均較低；而含有0.25 mg/L 6-BA和0.20 mg/L NAA的培養(yǎng)基，以及含有0.35 mg/L 6-BA和0.15 mg/L NAA的培養(yǎng)基對不定芽的誘導(dǎo)作用均較強(qiáng)，不定芽的發(fā)生頻率高，生長迅速，無玻璃化發(fā)生，是不定芽分化誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。部分不定芽分化誘導(dǎo)結(jié)果見圖2。

表2不同濃度6-BA和NAA配比對意大利生菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Table 2Effects of different concentrations of 6-BA and NAA ratio on lettuce callus

培養(yǎng)基編號SerialNo.6-BAmg/LNAAmg/L出愈率Recoveryrate∥%愈傷組織Callus褐化Browning玻璃化Vitrification10.10.0580.0++-20.10.1081.8+++++30.10.1583.3+++++40.10.2077.8++-50.20.0541.7++-60.20.1027.3++++++70.20.15100.0++--80.20.2053.8+++-90.30.05100.0+++-100.30.1063.6++--110.30.1541.7++++120.30.2054.5+++-130.40.05100.0++++-140.40.1091.7+++--150.40.1533.3++++160.40.2027.2++++++170.50.0550.0+++++180.50.1050.0++-190.50.1550.0+-+200.50.20100.0+++--

注：-不發(fā)生；+低等發(fā)生；++中等發(fā)生；+++高等發(fā)生。

Note：-，+，++ and +++ stand for no occurrence，low occurrence，medium occurrence and higher occurrence，respectively.

2.4再生苗生根培養(yǎng)條件在MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)6~12 d后，生根較早、生根數(shù)量較多的是添加0.25 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基的誘導(dǎo)芽，其次是添加0.35 mg/L 6-BA和0.15 mg/L NAA培養(yǎng)基的誘導(dǎo)芽。說明前期芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素濃度對后期生根有一定影響。

圖1　愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果Fig.1　The induction results of callus

培養(yǎng)基編號SerialNo.6-BAmg/LNAAmg/L不定芽Sprouting玻璃化Vitrification培養(yǎng)基編號SerialNo.6-BAmg/LNAAmg/L不定芽Sprouting玻璃化Vitrification10.150.10+-70.350.10+-20.150.15+-80.350.15+++-30.150.20+-90.350.20++40.250.10++-100.450.10+-50.250.15++110.450.15++-60.250.20+++-120.450.20+-

注：-不發(fā)生；+低等發(fā)生；++中等發(fā)生；+++高等發(fā)生。

Note：-，+，++ and +++ stand for no occurrence，low occurrence，medium occurrence and higher occurrence，respectively.

圖2　不定芽誘導(dǎo)結(jié)果Fig.2　The induction results of adventitious buds

3結(jié)論與討論

在植物基因轉(zhuǎn)化方式中，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)化技術(shù)最為成熟。生菜屬于菊科植物，是農(nóng)桿菌的天然宿主。研究者對多種基因型生菜進(jìn)行了誘導(dǎo)、分化及成苗最適條件研究。以散葉生菜大速生(LactucasativavarcapatataL.)子葉為試材，不同研究者獲得的最適誘導(dǎo)激素濃度不同，趙吉強(qiáng)等[2]在附加0.10 mg/L 6-BA及0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上獲得了最佳誘導(dǎo)生芽效果；而其他研究者則分別在附加1.5 mg/L 6-BA及0.2 mg/L IAA或0.5 mg/L 6-BA及0.5 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上獲得了最佳誘導(dǎo)生芽效果[1，3]?？梢?，在不同試驗條件下，即便是同種基因型的生菜分化誘導(dǎo)的最適激素濃度也會有明顯差異。與其他基因型生菜相比，意大利生菜具有生長周期短，一年可收獲四季的優(yōu)點(diǎn)。該研究以意大利生菜為試材，研究了愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽發(fā)生的最佳條件，建立了意大利生菜組織培養(yǎng)再生體系，與其他研究獲得的最佳誘導(dǎo)條件顯著不同[5]。該研究表明，意大利生菜愈傷組織誘導(dǎo)激素條件為0.5 mg/L 6-BA及0.20 mg/L NAA；不定芽誘導(dǎo)激素條件為0.25 mg/L 6-BA和0.20 mg/L NAA。在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化意大利生菜的最佳條件，為構(gòu)建功能性生菜提供可行途徑。

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Establishment of Tissue Culture System ofLactucasativaL. var.ramosaHort.

DENG Ying，LUO Wen*(Biology Department，Nanchang Normal University，Nanchang，Jiangxi 330032)

Abstract[Objective] To establish the tissue culture system forLactucasativaL. var.ramosaHort. [Method]LactucasativaL. var.ramosaHort. seeds were disposed with different concentration javelle (0，0.5%,1.0%，2.0%,4.0%)for sterilization,and aseptic seedlings were cultured on MS medium. Taking cotyledons from the 4-5 days of seedlings as explants，the ideal sorts and concentrations of plant hormones were tested for induction of calluses，buds and roots seperately. [Result]LactucasativaL. var.ramosaHort. seeds were disposed with 1.0% available chlorine javelle and aseptic seedlings were gotten on MS culture medium. Taking cotyledons from the 4-5 days of seedlings as explants，the ideal calluses were induced and generated on the medium of MS medium supplied with 0.5 mg/L 6-BA，0.20 mg/L NAA，30 g/L sucrose and 7 g/L agar. The most in favor medium for bud differentiation from calluses were MS medium supplied with 0.25 mg/L 6-BA，0.20 mg/L NAA,30 g/L sucrose and 7 g/L agar，which was also beneficial for rooting subsequently. [Conclusion] The appropriate concentration of 6-BA and NAA was effective forLactucasativatissue culture,and lay a foundation for establishing geetic transformation system ofLactucaSativeL. var.ramosaHort.

Key wordsLactucasativaL. var.ramosaHort.; Cotyledon; Tissue culture

收稿日期2015-12-18

作者簡介鄧瑩(1992- )，女，江西贛州人，本科生，專業(yè)：生物科學(xué)。*通訊作者，教授，博士，從事微生物學(xué)研究。

基金項目江西省自然科學(xué)基金項目(20151BAB205063)。

中圖分類號S 636.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-181-03