劉慶輝　劉　巖　石　敏　俞森洋

(解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京　100853)

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轉(zhuǎn)化生長因子-β1在成年大鼠高氧肺損傷中的表達及重組人促紅細胞生成素的影響

劉慶輝劉巖石敏俞森洋

(解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京100853)

〔摘要〕目的探討TGF-β1在成年大鼠高氧肺損傷中的表達及重組人促紅細胞生成素(rHuEPO)的影響。方法健康成年雄性SD大鼠48只，隨機分為6組，每組8只。其中5組吸入100%濃度氧氣，根據(jù)吸氧時間不同分為24 h組、48 h組、72 h組、96 h組，rHuEPO組吸氧時間96 h，在0、24、48、72 h時間點予rHuEPO 1 000 U/kg腹腔內(nèi)注射，對照組吸入空氣，即0 h組。頸動脈采血行動脈血氣分析并計算氧合指數(shù)。測定血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β水平，肺組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。Western印跡及免疫組化方法檢測肺組織轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1蛋白表達。結(jié)果隨暴露于高氧時間的延長，大鼠氧合指數(shù)呈逐漸下降趨勢，96 h達到最低值。血清中TNF-α、IL-1β水平逐漸增高，48 h達到高峰，此后開始下降。肺組織MDA含量逐漸增高，96 h達到峰值，SOD活性逐漸下降，96 h達到最低值。肺組織中TGF-β1蛋白表達逐漸增多。rHuEPO干預(yù)組同96 h組相比氧合指數(shù)增加，血清中TNF-α、IL-1β水平下降，肺組織MDA含量下降，SOD活性增高，肺組織中TGF-β1蛋白表達減少。結(jié)論rHuEPO通過下調(diào)TGF-β1蛋白表達及抗炎、抗氧化作用能夠減輕成年大鼠高氧肺損傷。

〔關(guān)鍵詞〕高氧；肺損傷；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；重組人促紅細胞生成素

第一作者：劉慶輝(1971-)男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事急性肺損傷的動物實驗研究。

呼吸衰竭的救治中常需要氧療，但持續(xù)高濃度氧療會導(dǎo)致成年人類似于急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的急性高氧肺損傷(HALI)和新生兒的支氣管肺發(fā)育不良〔1，2〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β是一個調(diào)節(jié)細胞生長和分化的細胞因子超家族，具有參與肺胚胎發(fā)育、組織損傷與修復(fù)的作用〔3〕，TGF-β1通過多種途徑參與了高氧肺損傷的發(fā)生、發(fā)展過程〔4〕。臨床上重組人促紅細胞生成素(rHuEPO)廣泛用于治療腎性貧血，并通過提高機體抑制脂質(zhì)過氧化的能力，具有抗凋亡的活性〔5〕。本研究重點觀察了TGF-β1在成年大鼠高氧肺損傷中的動態(tài)表達及rHuEPO干預(yù)對HALI的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物健康成年雄性清潔級SD大鼠48只，質(zhì)量291~315 g。

1.2實驗分組將48只大鼠隨機分為6組，每組8只。其中5組置入動物實驗氧艙(中國煙臺東科高壓氧設(shè)備有限公司)中，吸入100%氧氣，根據(jù)吸氧時間不同分別為0 h組(吸入空氣，即對照組)、24 h組、48 h組、72 h組、96 h組和rHuEPO干預(yù)組(吸氧時間為96 h，并分別于0、24、48、72 h腹腔內(nèi)注射rHuEPO 1 000 U/kg)。

1.3標(biāo)本采集到達各組實驗終點后，將大鼠移出氧艙，10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，分離右側(cè)頸總動脈并留取動脈血。取部分肺組織用4%多聚甲醛溶液固定，剩余肺組織置于液氮生物容器保存。肺組織勻漿液制備：每100 mg右肺組織加入0.9 ml PBS(pH 7.4)的比例，冰浴下用組織勻漿器制成10%的肺組織勻漿，3 000 r/min離心20 min，取上清液-20℃凍存。

1.4觀察指標(biāo)通過動脈血氧分壓(PaO2)結(jié)果計算氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)。放射免疫方法測定血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β含量。采用相應(yīng)的試劑盒測定肺組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。Western印跡方法檢測肺組織轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1蛋白表達，測定各蛋白電泳區(qū)帶的積分灰度值。免疫組織化學(xué)法檢測肺組織TGF-β1蛋白表達。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析采用Chiss統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2結(jié)果

2.1氧合指數(shù)48 h組(451.36±16.60)同24 h組(453.23±10.50)比較、24 h組同0 h組(452.98±8.10)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。72 h組(368.16±20.66)顯著下降，96 h組(123.39±11.46)達最低值。rHuEPO組(321.25±16.93)同96 h組比較顯著增高(P<0.01)。

2.2血清TNF-α、IL-1β水平隨氧氣吸入時間延長，血清TNF-α、IL-1β水平均逐漸增高，48 h達到峰值，此后逐漸下降，但96 h組仍高于正常組。rHuEPO干預(yù)組同96 h組比較均有顯著下降(P<0.01)。見表1。

表1　六組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平

與0 h組比較：1)P<0.05，與24 h組比較：2)P<0.01，與48 h組比較：3)P<0.01，與72 h組比較：4)P<0.01，與96 h組比較：5)P<0.01

2.3肺組織中MDA、SOD水平隨氧氣吸入時間的延長，大鼠肺組織中MDA水平逐漸增高，96 h達峰值，rHuEPO干預(yù)組較96 h組顯著下降；而大鼠肺組織中SOD活性呈逐漸下降，96 h達最低值，rHuEPO干預(yù)組較96 h組SOD活性顯著增高(P<0.01)。見表2。

表2　六組大鼠肺組織MDA、SOD的水平

與0 h組比較：1)P<0.01，與24 h組比較：2)P<0.01，與48 h組比較：3)P<0.01，與72 h組比較：4)P<0.01，與96 h組比較：5)P<0.01

2.4Western印跡方法檢測肺組織TGF-β1蛋白表達隨氧氣吸入時間延長，大鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達逐漸增加，24 h組蛋白電泳區(qū)帶的積分灰度值(149.93±7.66)較0 h組(109.02±10.74)、72 h組(219.56±9.25)較48 h組(198.21±9.44)顯著增高(P<0.01)，96 h組大鼠積分灰度值(244.04±10.72)達到峰值。rHuEPO組積分灰度值(220.03±12.21)較96 h組顯著下降(P<0.01)。

2.5免疫組織化學(xué)法檢測肺組織TGF-β1蛋白表達正常肺組織中TGF-β1有弱陽性表達，廣泛分布于肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞及血管周圍結(jié)締組織細胞。隨氧氣吸入時間延長，TGF-β1蛋白陽性細胞數(shù)量增多，胞質(zhì)/膜內(nèi)棕黃色顆粒也增多，并逐漸出現(xiàn)深棕黃色染色顆粒，甚至棕褐色顆粒，以96 h組大鼠病理改變最為明顯。rHuEPO組大鼠肺組織內(nèi)TGF-β1陽性細胞數(shù)量以及胞質(zhì)/膜內(nèi)棕黃色顆粒數(shù)量均較96 h組大鼠減少。見圖1。

圖1　各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白免疫組化染色(×400)

3討論

ARDS所致急性呼吸衰竭是一種常見呼吸系統(tǒng)急癥，通常需要給予高濃度的氧療，但持續(xù)吸入高濃度氧氣可導(dǎo)致機體肺組織結(jié)構(gòu)和功能的異常，即HALI〔1，2〕。高濃度氧持續(xù)吸入能直接造成肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞的損傷，活性氧種類(ROS)生成增多，巨噬細胞發(fā)生應(yīng)答，TNF-α、IL-1β開始表達，從而活化肺內(nèi)宿主細胞如內(nèi)皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞，導(dǎo)致趨化因子的產(chǎn)生〔6〕。

本研究選擇成年大鼠作為研究對象，置入動物實驗專用氧艙中，能夠提供穩(wěn)定可靠的氧濃度，給予持續(xù)高氧(100%氧氣)吸入，動態(tài)觀察成年大鼠高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展過程，能夠更好地模擬成年人氧中毒的肺部損害機制，不同于目前大部分高氧肺損傷局限在幼年或新生動物〔6〕。本研究提示TNF-α、IL-1β參與了高氧肺損傷發(fā)生的早期機制，通過作用于其他炎性細胞，進一步活化機體肺部炎癥反應(yīng)而加重肺損傷〔6〕。

MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化而形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。本研究顯示在高氧肺損傷時有大量的脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，這種氧化性損害持續(xù)存在，氧自由基與肺部脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，并引發(fā)脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng)，加重肺損傷。SOD是抗氧化酶類，SOD的高低可以間接反映機體清除氧自由基的能力，而霧化吸入胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)通過減輕肺水腫及全身氧化應(yīng)激反應(yīng)，能夠明顯改善大鼠的高氧肺損傷的程度〔7〕。本研究顯示高氧暴露后SOD的活性逐漸下降，反映機體抗氧化能力的下降。

TGF-β是一個具有調(diào)節(jié)細胞生長和分化的細胞因子超家族，具有調(diào)節(jié)細胞的生長、分化，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(ECM)的代謝，參與肺胚胎發(fā)育、組織損傷與修復(fù)的作用〔3〕。TGF-β1通過誘導(dǎo)ROS的生成并導(dǎo)致細胞活性的改變，破壞某些酶的活力，影響細胞膜的功能，造成嚴重的肺損傷〔4〕。TGF-β1可以趨化單核細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等，從而促使TNF-α、IL-1等細胞因子合成增加〔8〕。原位雜交技術(shù)顯示，高氧所致肺組織的異常修復(fù)過程在高氧暴露的早期就已出現(xiàn)〔4〕。本研究結(jié)果表明：隨著大鼠在高氧環(huán)境暴露時間的延長，肺組織TGF-β1表達逐漸增加，并于96 h達到高峰，TGF-β1通過上述途徑調(diào)節(jié)高氧肺損傷的多個環(huán)節(jié)〔4，8〕。

促紅細胞生成素(EPO)是腎臟產(chǎn)生的一種30.4 kD的糖蛋白，廣泛用于治療腎性貧血，并對急性腎損傷有一定保護作用〔9〕。近年研究表明EPO可減輕氧化應(yīng)激相關(guān)的脂質(zhì)過氧化，具有抗凋亡的活性〔10〕，通過抑制多形核白細胞的聚集，減少前炎性因子TNF-α、IL-1β向血液循環(huán)中的釋放，能夠減輕脂多糖及缺血再灌注所致肺損傷〔11，12〕。本研究結(jié)果提示，應(yīng)用rHuEPO預(yù)處理后大鼠氧合狀況明顯改善，血清中細胞因子TNF-α、IL-1β水平顯著下降，肺組織MDA含量顯著下降，SOD活性顯著增高，肺組織TGF-β1表達顯著下降。研究結(jié)果表明：rHuEPO具有下調(diào)大鼠肺組織TGF-β1表達及一定程度的抗炎、抗氧化作用，對高氧所致成年大鼠急性肺損傷具有一定程度的保護作用。

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〔2014-12-10修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：俞森洋(1947-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事老年呼吸衰竭救治、機械通氣研究。

基金項目：北京市自然科學(xué)基金課題(7082088)

〔中圖分類號〕R563

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0572-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.025