及　昕　崔磊華　張　寧　韓明林　韓成敏

(吉林大學口腔醫(yī)學院，吉林　長春　130021)

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口腔鱗狀細胞癌患者唾液的代謝組學分析

及昕崔磊華張寧韓明林韓成敏

(吉林大學口腔醫(yī)學院，吉林長春130021)

〔摘要〕目的利用基于液相-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學研究方法尋找口腔鱗狀細胞癌(OSCC)患者唾液中潛在的生物標志物。方法采用高分離度快速液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(RRLC/Q-TOF/MS)技術(shù)對OSCC患者和健康人的唾液樣品進行分析，分別獲得兩組樣品的代謝輪廓，同時運用主成分分析法(PCA)技術(shù)對兩組代謝物進行分類，并尋找潛在的生物標志物。 結(jié)果RRLC/Q-TOF/MS檢測結(jié)果顯示，OSCC組和健康組人群唾液代謝輪廓存在明顯的差異，發(fā)現(xiàn)并鑒定得到了7個OSCC相關(guān)的生物標志物，分別為膽堿、葡萄糖、色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、肉毒堿，與正常健康人相比，膽堿的代謝趨勢上調(diào)，其余代謝物的趨勢均下調(diào)。 結(jié)論與健康人相比，OSCC患者主要存在著氨基酸代謝和能量代謝失衡的現(xiàn)象，同時三羧酸循環(huán)代謝異常，為將來的臨床診斷和治療提供了重要的信息。

〔關(guān)鍵詞〕口腔鱗狀細胞癌;唾液;高分離度快速液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜;代謝組學

第一作者：及昕(1968-)，女，主管護師，主要從事口腔護理臨床研究。

WHO報道，從確定上皮源性的鱗狀細胞癌(OSCC)診斷開始，口腔癌患者的五年存活率為55%左右〔1〕。有報道指出,早期診斷OSCC可以使其五年成活率達到80%~90%〔2〕。近年來，通過代謝組學的方法尋找患者的特異性生物標志物來診斷疾病已經(jīng)受到越來越多學者的關(guān)注。可以用以檢測的生物體液通常包括血液、尿液、唾液等。其中唾液具有收集簡單方便，無痛等優(yōu)點〔3〕，本研究通過高分離度快速液相色譜與四級桿-飛行時間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF-MS)聯(lián)用的技術(shù)對健康人及臨床已經(jīng)診斷為OSCC患者的唾液進行了代謝輪廓研究，旨在尋找潛在的生物標志物。

1材料與方法

1.1實驗材料Agilent 1200 型RRLC系統(tǒng)，Agilent 6520 Q-TOF 質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，配有ESI 離子源及Mass Hunter 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Mass Profile Professional(MPP)統(tǒng)計軟件(安捷倫公司)。甲醇、甲酸、乙腈(色譜純，美國 Tedia 公司)，實驗用水由 Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備。

1.2實驗方法

1.2.1樣品采集臨床樣品采自吉林大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科，包括16例OSCC患者(男12例，女8例)，年齡45～63歲〔平均(54.9 ±5.5)〕歲，所有患者均征得患者本人同意，并由入院前行病理切片檢查確定病情后，分別在手術(shù)前(未行化療藥物治療)行唾液樣品采集。 以16例正常人(男12例和女8例)，年齡42～60歲，平均(51.0±7.2)歲，設為空白對照組。采集前確保受試者的口腔黏膜、牙齦無出血、潰瘍等病變，術(shù)前不少于1 h患者無進食、飲水、吸煙。以吐口水的方式收集唾液3 ml于離心管中，其中離心管處于充滿碎冰的杯子中，同時提醒患者不要咳出痰液。

1.2.2樣品處理方法取200 μl唾液中加入200 μl甲醇/乙腈(1∶1，v/v)溶液，渦旋15 s充分混勻溶液，4℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液-80℃保存。

1.2.3色譜-質(zhì)譜條件

1.2.3.1色譜條件Agilent Eclipse Plus C18(2.1×100 mm，3.5 μm)；流動相A為超純水溶液(0.1%甲酸)，流動相B為乙腈；流動相洗脫程序為0～5 min，10%～20% B;5～7 min，20%～30% B;7～12 min，30%～80% B;12～14 min，80%～85%B;14～17 min，85%～95%B;17～22 min，95%～100%B。柱溫30℃，流速：0.3 ml/min，進樣量10 μl。

1.2.3.2MS條件采用電噴霧正離子模式(ESI+)；干燥氣溫度：300℃；質(zhì)量掃描范圍50~1 000 m/z；干燥氣流速9 L/min，噴霧氣壓 40 psig；毛細管電壓 3.5 kV。

1.4數(shù)據(jù)處理經(jīng)預處理后的唾液樣品運用RRLC-MS進行檢測，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Masshunter Qualitative Analysis(B.03.01)數(shù)據(jù)處理軟件進行分子特征識別，之后將所得數(shù)據(jù)導入MPP統(tǒng)計軟件中進行濾噪和歸一化處理，并進行主成分分析。

2結(jié)果

2.1OSCC患者與健康人唾液質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析圖1為正常人和OSCC患者唾液典型的總離子流色譜圖，可以觀察到兩者的總離子流圖存在著明顯的差異。經(jīng)MPP軟件進行峰的提取和匹配后，在唾液中共識別出了116個代謝物的離子信息。為了將健康人和OSCC患者進行區(qū)分，對所收集的唾液樣品的實驗數(shù)據(jù)進行了主成分分析(PCA)，見圖2和圖3，兩者在得分圖中實現(xiàn)了明顯的區(qū)分，這說明OSCC患者與健康人相比唾液中的代謝物譜發(fā)生著明顯的變化。

圖1　唾液樣品的典型總離子流圖

2.2差異代謝物鑒定結(jié)果進一步比較OSCC組和健康對照組兩者之間唾液中的代謝差異，依據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、二級質(zhì)譜(MS2)信息及NIST 、HMDB、METLIN、KEGG 等數(shù)據(jù)庫信息進行結(jié)構(gòu)鑒定，最后用標準品對其中幾個鑒定結(jié)果進行驗證。鑒定出了7種生物標志物，分別是色氨酸、苯丙氨酸 、葡萄糖、谷氨酸、肉毒堿、谷氨酰胺、膽堿,鑒定結(jié)果及變化趨勢見表1，除膽堿OSCC組與健康組倍數(shù)變化趨勢為升高外，其余6種標志物趨勢均下調(diào)。

(■：OSCC組，▲：健康對照組)圖2　OSCC患者和健康組唾液的PCA二維得分圖

(■：OSCC組，▲：健康對照組)圖3　OSCC患者和健康組唾液的PCA-3D得分圖

代謝物質(zhì)量(m/z)P值OSCC組vs健康組(倍數(shù))代謝途徑色氨酸204.08994.52×10-21.47氨基酸代謝肉毒堿161.10524.83×10-21.53脂肪酸β-氧化谷氨酰胺146.06912.13×10-31.31氨基酸代謝苯丙氨酸165.07901.02×10-32.17氨基酸代謝膽堿121.11033.13×10-41.61脂類代謝葡萄糖180.06343.82×10-30.97糖代謝谷氨酸147.05321.37×10-41.74氨基酸代謝

3討論

OSCC的發(fā)病率正在逐年升高，據(jù)文獻調(diào)查，我國OSCC的發(fā)病率約為3.6/10萬~8.0/10萬人〔4〕，如今已成為我國常見的惡性腫瘤之一。為了診斷OSCC,CT、MRI以及多普勒彩色超聲介導下的細針穿刺細胞活檢技術(shù)，只能夠大概定性腫物的良惡性質(zhì)。目前只有腫物的病理組織活檢術(shù)才是診斷的唯一標準，但由于地域，醫(yī)院級別，醫(yī)師經(jīng)驗等原因，往往許多患者錯過了治療的最佳時機。

代謝組學技術(shù)通過對機體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析，已成為探索人體疾病、診斷疾病的重要手段。文獻報道，通過代謝組學技術(shù)，已有多種疾病通過生物體液檢測到了相關(guān)的代謝標志物,而癌癥標志物的檢測更是受到了眾多的關(guān)注，如乳腺癌〔5〕、膽道癌〔6〕等。Chen等〔7〕采用HILIC和RPLC對肝癌和健康人的尿液進行分析，發(fā)現(xiàn)了21種作為生物標志物的代謝物離子，同時指出兩組受試人群在某些氨基酸代謝和脂肪酸氧化方面存在著明顯的差異。唾液作為人體的體液之一，由于唾液樣品采集具有非侵襲性，受試者無傷害、無痛苦，取樣不受時間、地點的限制，因而樣品容易獲得。唾液作為檢測人類機體健康和疾病的新興遞質(zhì)，近些年受到越來越多的關(guān)注，使用唾液進行疾病的診斷和健康的檢測將是一種很有前途的檢測方法。

根據(jù)Warburg Effect效應，不同于正常細胞的分化，大多數(shù)腫瘤細胞主要是通過糖酵解作用而產(chǎn)生能量〔8〕。在有氧的條件下，葡萄糖經(jīng)過糖酵解作用逐步分解生成乙酰CoA進入三羧酸循環(huán)，而三羧酸循環(huán)不僅是三大類物質(zhì)(糖類、脂類、氨基酸)的最終代謝通路，也是糖類、脂類、氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐。三羧酸循環(huán)的起始物為乙酰CoA，它既是糖氧化分解的產(chǎn)物，也是體內(nèi)脂類代謝和某些氨基酸代謝的產(chǎn)物，而色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺則是氨基酸代謝的重要產(chǎn)物。苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，在體內(nèi)大部分經(jīng)酶催化作用氧化成為酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機體糖代謝和脂類代謝。

膽堿是卵磷脂和鞘磷脂的重要組成部分，也是乙酰膽堿的前體。而膽堿代謝異常是腫瘤形成與發(fā)展的特征之一，作為乙酰膽堿的前體物質(zhì)，膽堿在體內(nèi)多種代謝過程中都起著至關(guān)重要的作用，尤其是磷脂的生物合成。腫瘤細胞在不斷增殖過程中時，由于膜的不斷合成，需要高水平的膽堿轉(zhuǎn)化為磷脂酰膽堿，因此相比于健康人群，在OSCC患者的唾液中膽堿的含量要高些。當然膽堿代謝異常也有可能是膽堿磷酰化過程中關(guān)鍵酶的高表達效果。谷氨酰胺和谷氨酸通過體內(nèi)酶的作用，二者可以相互轉(zhuǎn)化。其中谷氨酰胺在免疫細胞的分裂和增殖過程中起到了正調(diào)控的作用，同時谷氨酰胺在淋巴細胞的分泌和增殖過程中也起到了關(guān)鍵性的作用，并且參與了淋巴細胞功能的維持。而口腔鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移主要途徑是淋巴道轉(zhuǎn)移，谷氨酰胺含量的降低與OSCC的淋巴道轉(zhuǎn)移是否有關(guān)，還有待于進一步研究。肉堿由賴氨酸和蛋氨酸合成，在長鏈脂肪酸的β-氧化過程中起著至關(guān)重要的作用，當然其最重要的已知的代謝功能就是可以促進脂肪的運輸，幫助脂肪酸運輸?shù)骄€粒體中，在能量代謝中起著關(guān)鍵性的作用。乙酰輔酶A經(jīng)β-氧化生成并進入三羧酸循環(huán)，最終氧化成為CO2，這也導致了能量運載體的減少。與健康人相比，OSCC患者肉堿含量的降低可能由于OSCC患者脂肪酸代謝下調(diào)所致。

本研究運用了基于RRLC-Q-TOF-MS的代謝組學技術(shù)研究了OSCC患者與健康人群的唾液樣品，得到了OSCC患者唾液的代謝輪廓，并發(fā)現(xiàn)OSCC患者與健康人群的唾液代謝譜存在著明顯的差異，找出并鑒定了7種生物標記物。同時，根據(jù)相關(guān)代謝通路的分析，與健康人相比，這些生物標記物的變化反映了OSCC患者主要存在著氨基酸代謝水平提高和能量代謝失衡的現(xiàn)象，同時三羧酸循環(huán)代謝異常。而由于樣品量有限，也導致了實驗的局限性，因此還需要大批量的樣品和細胞水平實驗的驗證。

4參考文獻

1鄭家偉,李金忠,鐘來平,等.口腔鱗狀細胞癌臨床流行病學研究現(xiàn)狀〔J〕.中國口腔頜面外科雜志,2007;5(2):83-90.

2Liu SA,Tsai WC,Wong YK,etal.Nutritional factors and survival of patients with oral cancer〔J〕.Head Neck,2006;28(11):998-1007.

3Hanne CB,Nina E,Nanna E,etal.Potential of human saliva for nuclear magnetic resonance-based metabolomics and for health-related biomarker identification〔J〕.Anal Chem,2009;81:9188-93.

4Liu Q,Sun B,Zhang Q,etal.Metabonomics and its applications in early diagnosis of diseases〔J〕.J Int Pharm Res,2013;40(3):265-70.

5 Zhang L,Xiao H,Karlan S,etal.Discovery and preclinical validation of salivary transcriptomic and proteomic biomarkers for the non-invasive detection of breast cancer〔J〕.PLoS One,2014;DOI:10.1371.

6Wen H,Yoo SS,Kang J,etal.A new NMR-based metabolomics approach for the diagnosis of biliary tract cancer〔J〕.J Hepatol,2010;52(2):228-33.

7Chen J,Wang W,Lv S,etal.Metabonomics study of liver cancer based on ultra performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry with HILIC and RPLC separations〔J〕.Anal Chim Acta,2009;650(1):3-9.

8Matthew G,Vander H,Lewis C,etal.Understanding the warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation〔J〕.Science,2009;324(5930):1029-33.

〔2015-03-15修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：韓成敏(1958-)，男，教授，主要從事口腔頜面部腫瘤研究。

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(2009-11-13)

〔中圖分類號〕R739.8

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0560-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.019