李純榮

(惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東　惠州　516025)

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苦瓜藥用有效成分的提取及誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用

李純榮

(惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東惠州516025)

〔摘要〕目的探討苦瓜藥物有效成分的提取及誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。方法提取新鮮苦瓜蛋白，配置成不同濃度梯度溶液5、10、15、20、50 μg/ml(干預(yù)組)，分別干預(yù)A549細(xì)胞不同時(shí)間6、12、24、48、36 h，凋零組只加培養(yǎng)液、對(duì)照組(0 μg/ml)不干預(yù)，操作步驟與干預(yù)組均相同，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)測(cè)定細(xì)胞抑制率，TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡率，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。結(jié)果干預(yù)24、36、48 h時(shí)，濃度為5~50 μg/ml。不同濃度梯度細(xì)胞OD值分別與相應(yīng)的對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦瓜蛋白與細(xì)胞抑制率間存在明顯劑量-反應(yīng)關(guān)系(r=0.453,P<0.05)；選擇細(xì)胞抑制率在50%以下的濃度梯度分別為0、5、10、15、20 μg/ml，對(duì)A549細(xì)胞干預(yù)24 h，細(xì)胞凋亡率分別為(2.69±0.35)%、(12.30±0.28)%、(42.23±2.31)%、(31.67±1.25)%、(35.25±2.41)%，其中苦瓜蛋白在10 μg/ml時(shí)細(xì)胞凋亡率最高。結(jié)論苦瓜蛋白對(duì)于肺癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡率。

〔關(guān)鍵詞〕苦瓜蛋白；肺癌細(xì)胞A549；凋亡

第一作者：李純榮(1977-)，男，講師，主要從事生物方面的研究。

目前臨床上治療肺癌的主要方法為根治性手術(shù)治療、化療、放療等，雖然具有一定的治療效果，但是隨訪肺癌外科治療的五年生存率僅為30%～44%〔1〕?？喙现嗅t(yī)價(jià)值高，其活性成分種類繁多，包括三萜類、生物堿類、甾類化合物、糖類、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸類及微量元素等〔2〕，臨床已經(jīng)發(fā)現(xiàn)苦瓜蛋白具有明顯的抗腫瘤、病毒的作用，是苦瓜最主要的藥用成分〔3〕。本文通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討苦瓜中藥用蛋白對(duì)肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞的作用。

1資料與方法

1.1材料與儀器A549細(xì)胞(購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司)，Hyclone胎牛血清，DMEM(Dulbecco minimum essential medium,DMEM)培養(yǎng)基(北京天恩澤基因科技有限公司)，酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、流式細(xì)胞儀(銳賽生物技術(shù)有限公司)，顯影液及定影液(Kodak公司)，陽(yáng)離子交換層析柱(南京大學(xué)普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所)，低速離心機(jī)(臥螺離心機(jī)械有限公司)，高速離心機(jī)，sephadex 75(天地人和生物科技有限公司)，SAC-Biol蛋白純化層析柱(利蕙科技生物有限責(zé)任公司)，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(上海伯楷安)。MTT實(shí)驗(yàn)(上海博谷生物科技有限公司)、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海前塵生物科技有限公司)，Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1苦瓜藥用成分的提取(1)摘取新鮮的苦瓜，稱重，置于粉碎機(jī)粉碎、壓榨、在濾網(wǎng)上過(guò)濾，應(yīng)用溶劑浸泡提取的提取液，然后1 000 r/min離心5 min收取上清液，應(yīng)用乙醇沉淀上層清液，過(guò)濾，離心分離，多糖類不溶于乙醇，需以纖維狀沉淀析出。沉淀物經(jīng)過(guò)凍干，Sephadex G75溶解過(guò)柱，干燥的苦瓜多糖，在A280監(jiān)視下收集蛋白粉組分，透析離心、溶解透析物，6 000 r/min離心30 min，沉淀物雙蒸水溶解，置于透析袋中透析24 h。濾液經(jīng)脫脂、脫蛋白提取苦瓜甙，整個(gè)操作過(guò)程控制室內(nèi)溫度在4℃。(2)苦瓜蛋白免疫親和層析純化。吸取上述透析的苦瓜蛋白粗提取物，于陽(yáng)離子交換層析柱中，并且以相應(yīng)的洗脫液梯度洗脫，分管收集，并且在紫外波段280 nm檢測(cè)，部分苦瓜蛋白以SDS-PAGE電泳檢測(cè)洗脫組分，相同組分合并，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。(3)過(guò)濾凝膠。取上述陽(yáng)離子交換層析中洗脫的蛋白組分上樣于SuPerdex75層析柱行凝膠過(guò)濾，再次洗脫，流速2 ml/min，收集洗脫峰蛋白組分，SDS-PAGE電泳檢測(cè)洗脫組分，冷凍干燥，-80℃保存待測(cè)。

1.2.2A549培養(yǎng)和細(xì)胞抑制A549細(xì)胞接種于含有12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中復(fù)蘇、換液(隔天換)、傳代、凍存等操作步驟均符合常規(guī)操作。利用四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法測(cè)定細(xì)胞抑制率，苦瓜蛋白濃度梯度設(shè)置：5、10、15、20、50 μg/ml(干預(yù)組)，干預(yù)時(shí)間：6、12、24、36、48 h。將細(xì)胞對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)較好的細(xì)胞按照5×104個(gè)/ml細(xì)胞密度接種于96孔板上，設(shè)置調(diào)零組、對(duì)照組(0 μg/ml)，凋零組只加培養(yǎng)液、對(duì)照組只加細(xì)胞不干預(yù)，其他的步驟與干預(yù)組相同，每個(gè)濃度梯度共加5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后給予苦瓜蛋白干預(yù)，分別按照時(shí)間設(shè)置干預(yù)。酶標(biāo)儀450 nm，測(cè)量吸光度(OD)。細(xì)胞抑制率=1-(干預(yù)組OD-凋零組OD)/(對(duì)照組OD-凋零組OD)×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用TUNEL方法，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)較好的細(xì)胞按照5×104個(gè)/孔接種于24孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，分別按照0、5、10、15、20 μg/ml苦瓜蛋白干預(yù)24 h，吸取培養(yǎng)液到一合適EP管中，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞吸入EP中，按照TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行，加完樣后流式細(xì)胞儀檢測(cè)或者熒光顯微鏡分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析、秩和檢驗(yàn)、Dunnett-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson系數(shù)。

2結(jié)果

2.1苦瓜蛋白對(duì)A549抑制作用苦瓜蛋白干預(yù)細(xì)胞干預(yù)12 h濃度為50 μg/ml。干預(yù)24、36、48 h時(shí)，濃度為5~50 μg/ml。不同濃度梯度細(xì)胞OD值分別與相應(yīng)的對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)6、12 h各梯度OD值與對(duì)照組相比，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)12 h苦瓜蛋白50 μg/ml細(xì)胞抑制率為9.78%，干預(yù)24 h苦瓜蛋白5、10、15、20、50 μg/ml細(xì)胞抑制率分別為9.73%、15.86%、22.80%、30.02%、35.10%，干預(yù)36 h抑制率分別為10.13%、17.81%、30.13%、48.08%、36.71%，干預(yù)48 h抑制率分別為33.83%、47.07%、56.40%、72.34%、87.43%，苦瓜蛋白與細(xì)胞抑制率間存在明顯劑量-反應(yīng)關(guān)系(r=0.453,P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各劑量苦瓜蛋白對(duì)A549作用不同時(shí)間的OD值±s)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05

2.2苦瓜蛋白對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用樣品處理后經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，選擇細(xì)胞抑制率在50%以下的濃度梯度，分別為0、5、10、15、20 μg/ml。苦瓜蛋白不同濃度梯度干預(yù)A549細(xì)胞 24 h。首先在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯凋亡小體，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞處于萎靡狀態(tài)。細(xì)胞凋亡率分別為(2.69±0.35)%、(12.30±0.28)%、(42.23±2.31)%、(31.67±1.25)%、(35.25±2.41)%，其中苦瓜蛋白在10 μg/ml時(shí)細(xì)胞凋亡率最高。

3討論

苦瓜是葫蘆科植物，為一年生攀緣草本，具有較高的藥用和食用價(jià)值，其中苦瓜蛋白是從苦瓜籽中分離出來(lái)的一種分子量約為30 kD的堿性糖蛋白質(zhì)，屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白(RIP)〔4〕，臨床上發(fā)現(xiàn)RIP成分可以有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，例如誘導(dǎo)黑色素瘤，橫紋肌肉瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)〔5〕苦瓜蛋白干預(yù)細(xì)胞利用穩(wěn)定高效的細(xì)胞源性一氧化氮(NO)供體系統(tǒng)與A549共培養(yǎng)建立NO誘發(fā)肺癌細(xì)胞凋亡模型，在培養(yǎng)換液時(shí)，加入含不同濃度的苦瓜蛋白培養(yǎng)液，分別在加藥前及加藥后24、48、72 h選取標(biāo)本進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、光鏡觀察，同時(shí)用苦瓜蛋白抗體及熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗〔6〕，熒光顯微鏡觀察苦瓜蛋白與肺癌細(xì)胞的結(jié)合及定位，可以觀察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化〔7〕。

本研究說(shuō)明了對(duì)于A549誘導(dǎo)凋亡需在苦瓜蛋白適合濃度作用下比較明顯，這可能與細(xì)胞密度和細(xì)胞生長(zhǎng)速度有關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種生理基因控制的程序化變化，其凋亡機(jī)制受多種信號(hào)通路誘導(dǎo)，主要包括死亡受體途徑、線粒體依賴的信號(hào)通路。韓義香等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)苦瓜蛋白可以不同程度地下調(diào)p42P44-MAPK和磷酸化p42P44-MAPK的表達(dá)，MAPK信號(hào)通路可能部分參與了苦瓜蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,對(duì)于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的其他機(jī)制有待后期的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-08-26修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)04-0784-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.006