勾明江，許子競, 劉 茜

(1.2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 天然產(chǎn)物中心，貴州 畢節(jié) 551700；3.梧州學(xué)院，廣西 梧州 543000)

響應(yīng)面優(yōu)化法提取玫瑰花渣多糖的工藝研究

勾明江1，許子競2, 劉 茜3

(1.2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 天然產(chǎn)物中心，貴州 畢節(jié) 551700；3.梧州學(xué)院，廣西 梧州 543000)

該文以玫瑰花渣為原料，利用響應(yīng)面法對玫瑰花渣多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時間、液料比為影響因子，以多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 中心組合實驗設(shè)計原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法，建立二次回歸模型，研究各變量交互作用及其對玫瑰花渣多糖提取得率的影響。結(jié)果表明，通過方差分析可知各因素對玫瑰花渣多糖提取得率影響的大小依次為提取溫度、時間、料液比。玫瑰花渣提取多糖的最佳工藝條件為：浸提溫度82℃、浸提時間37 min、料液比1∶26(g/mL)，在此條件下玫瑰花渣多糖提取得率可達1.585%，與模型預(yù)測值1.592%高度相符。

玫瑰花渣多糖；響應(yīng)面分析法；提??；優(yōu)化

玫瑰花(rose flower)是多年生灌木薔薇科植物玫瑰(rosa rugosa thumb)的干燥花蕾,在我國有兩千多年的栽培及藥用歷史[1-2]。玫瑰花是提取玫瑰精油的原料。玫瑰花經(jīng)蒸餾揮發(fā)油后剩下大量的玫瑰花渣[3]；研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰花渣中營養(yǎng)成分和功效成分十分豐富，如含有微量元素、蛋白質(zhì)、糖類、黃酮 (花色素、槲皮素)、有機酸、生物堿、鞣質(zhì)、酚類等多種成分，因此玫瑰花渣具有很高的再利用價值[4-5]。目前，國內(nèi)外對于玫瑰花的研究比較廣泛，但對玫瑰花渣的研究較少，尤其是具有生物活性的玫瑰花渣多糖(rose flower dregs polysaccharides ,RFDP)研究更少。本試驗利用超聲波輔助提取玫瑰花渣中的多糖[6-8]，并通過響應(yīng)面法對提取工藝進行優(yōu)化[9]，為進一步開發(fā)玫瑰花渣資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

玫瑰花由貴州畢節(jié)市撤拉溪鄉(xiāng)玫瑰種植合作社提供；純化水(實驗室制備)、丙酮、無水乙醇、甲醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等，均為分析純。

1.2 主要儀器

TDL-5C臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；2102PCS紫外-可見分光光度計：尤尼科(上海)儀器有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BSZ-100B)：上海亞榮生化有限公司。

2試驗方法

2.1 玫瑰花渣多糖提取工藝流程

玫瑰花→蒸餾玫瑰油→ 玫瑰花渣→稱重(計算干重)→超聲波輔助純化水提取3次→合并提取液→濃縮至體積的1/3→離心→離心液→苯酚-硫酸顯色→紫外光下檢測吸收峰值→計算提RFDP的提取得率。

2.2 工作曲線和回歸方程

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖白色粉末0.0500g至500 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，搖勻待用。分別吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(100μg/mL) 1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL到10mL容量瓶中，加水定容，然后分別移取1mL于7支試管中，各加入5%苯酚溶液1mL和4mL濃硫酸，充分搖勻，靜置30min ,冷卻至室溫。以蒸餾水為參比，在UV490nm波長處測各管的Abs值，以葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A =0.0106C+0.1472，R2=0.9995。

2.3 樣品中多糖化合物含量的測定

準(zhǔn)確稱取樣品2.000g于250 mL三角瓶中，超聲提取3次，抽濾，合并濾液，定容至100 mL 容量瓶中，搖勻。移取25 mL于50 mL的容量瓶中進行稀釋2倍，玫瑰花渣多糖類化合物的產(chǎn)率計算為：

多糖產(chǎn)率/% =C×D×f÷W× 100

式中：C為供試液中葡萄糖濃度，mg/mL；D為多糖的稀釋因素，mL；f為換算因子；W為供試玫瑰花渣樣品的重量，mg。

3結(jié)果與討論

3.1 RFDP提取的單因素試驗

影響RFDP提取的因素很多，本試驗主要討論提取溫度、時間和料液比三因素對RFDP提取得率的影響。

3.1.1 時間的影響

圖1 時間對RFDP提取得率的影響

固定提取溫度80℃、料液比1:20(g/mL)，研究時間對RFDP提取得率的影響。從圖1可知，時間對RFDP的提取得率有明顯的影響，從20min～35min，RFDP的提取得率上升較快，而從35min后提取得率幾乎不變，說明提取35min比較適宜。

3.1.2 溫度的影響

圖2 溫度對RFDP提取得率的影響

固定提取時間35min、料液比1:20(g/mL)，研究溫度對RFDP提取的影響。從圖2可知，溫度對RFDP的提取得率的影響比較顯著，從65℃～80℃，RFDP的提取得率達到最大，而從80℃后提取得率開始略有下降，說明80℃提取較適宜。

3.1.3 料液比的影響

固定提取溫度80℃、提取時間35min，研究料液比對RFDP提取的影響。從圖3可知，料液比從1:10(g/mL)提高到1:25(g/mL)，RFDP的提取得率逐漸升高，而隨著料液比增加，RFDP的提取得率幾乎不變，說明料液比在1:25(g/mL)時，RFDP的提取較適宜。

圖3 料液比對RFDP提取得率的影響

3.1.4 提取次數(shù)的影響

批次料以提取溫度75℃、時間16min，第1次提取料液比1:6，后3次提取料液比1:4，提取3批次，每批次提取得率如表1。

表1 提取次數(shù)對RFDP提取得率的影響

提取批次批次料提取次數(shù)提取得率%1234總提取得率%第4次提取占總提取得率百分比%11.020.340.210.0111.5810.6921.010.350.220.0031.5830.1931.000.340.240.0061.5860.38

由表1可知，批次試驗中，提取得率隨提取次數(shù)增加，提取得率逐漸減少，第4次提取得率占批次料總提取得率<1%，說明試驗每批次料提取3次比較合適。

3.2 響應(yīng)面分析法對RFDP提取工藝的優(yōu)化

3.2.1 響應(yīng)面分析因素的選擇

運用SAS 8.1軟件程序，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理[9-10]，綜合上面單因素的實驗結(jié)果，以提取溫度、提取時間和料液比為三影響因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平

因素水平-101時間(Z1/min)253545溫度(Z2/℃)758085料水比(Z3/g/mL)1:201:251:30

3.2.2 響應(yīng)面分析

分別對提取時間(X1)、提取溫度(X2)和料液比(X3)作變換：設(shè)X1= (Z1-35) /10，X2= (Z2-80) /5，X3= (Z3-25) /5，以X1、X2、X3為自變量，RFDP的提取得率為響應(yīng)值(Y)，試驗方案及結(jié)果如表3,回歸模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗如表4。

表3 Box-Behnken中心組合設(shè)計方案及試驗結(jié)果

序號編碼值真實值X1X2X3時間/min溫度/℃料液比(g/mL)吸光度提取得率/%1-1-1025751∶250.6121.1272-11025851∶250.7151.42831-1045751∶250.6361.387411045851∶250.7201.45850-1-135751∶200.6231.28260-1135751∶300.6261.356701-135851∶200.7251.515801135851∶300.7301.5179-10-125801∶200.6151.3281010-145801∶200.7201.48911-10125801∶300.7081.4001210145801∶300.7451.5071300035801∶250.7551.5651400035801∶250.7511.5641500035801∶250.7571.567

表4 回歸模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗

方差來源自由度平方和均方F值P值顯著性X110.03890.03891295.910.0001***X210.07330.07332442.100.0001***X310.00340.0034114.690.0001***X1X110.03760.03761252.040.0001***X1X210.01320.0132440.340.0001***X1X310.00070.000724.270.0043**X2X210.04830.04831609.430.0001***X2X310.00130.001343.150.0012**X3X310.00410.0041137.280.0001***總回歸90.21200.0236784.410.0001***失擬差30.00010.000120.780.046*總殘差50.00020.00003總離差140.2122R2=99.80%R2adj=99.93%

注∶*P<0.05，表示差異顯著；**P<0.01，表示差異非常顯著,* * *P<0.001，表示差異極顯著。

表3中，1～12是析因試驗，13～15是中心試驗。15個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在所構(gòu)成的三維頂點，零點為區(qū)域的中心點，零點重復(fù)3次，用以估計試驗的誤差。用SAS RSREG程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進行回歸分析，分析結(jié)果見表4，響應(yīng)面和等高線圖見圖4、圖5、圖6。各因素經(jīng)回歸擬合，得回歸方程：

Y1=1.57+0.0698X1+0.0958X2+0.0208X3-0.1009X1X1-0.0575X1X2- 0.0135X1X3- 0.1144X2X2-0.018X2X3-0.018X3X3

(1)

從表4回歸分析可以看出，模型回歸差異極顯著。一次項X1、X2、X3對RFDP提取得率的影響極顯著，三因素影響順序為X2>X1>X3(以P值及F值的大小判斷)，二次項X1X1、X2X2、X3X3對RFDP提取得率的影響極顯著，交互項X1X2對RFDP提取得率的影響極顯著，X1X3、X2X3對RFDP提取得率的影響非常顯著。回歸方程的F值為784.41，P<0.001，且失擬誤差的P值為0.046，顯著，這說明，利用響應(yīng)面法擬合得到的試驗?zāi)Ｐ蜆O顯著，按照擬合模型得到的回歸方程，考察其因變量與自變量之間的線性相關(guān)系數(shù)，r= 99.80% / 99.93% = 0.9987，表明用該數(shù)學(xué)模型來評估各相關(guān)因素對RFDP提取得率的影響可信度較高。

圖4 Y = f (X1、X2)的響應(yīng)面與等值線圖

圖5 Y = f (X1、X3)的響應(yīng)面與等值線圖

圖6 Y = f (X2、X3)的響應(yīng)面與等值線圖

圖4—圖6直觀地反映了各因素對響應(yīng)值Y的影響，給出了各個因子交互作用的響應(yīng)面的3D和等值線分析圖。從響應(yīng)面的最高點和等值線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點。

為了進一步確定最佳點的值，對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)得：

0.0698- 0.2018X1-0.0575X2-0.0135 X3= 0

(2)

0.0958-0.0575X1-0.2288X2-0.018X3= 0

(3)

0.0208- 0.0135X1-0.018 X2-0.036X3= 0

(4)

解方程組得：X1= 0.2357，X2= 0.3458，X3= 0.1697 代入方程(1)得：Z1= 37.357，Z2= 81.729，Z3= 25.849，即RFDP的最佳提取時間：37.357 min，提取溫度：81.729℃，料液比：1:26.849，在此條件下，RFDP的理論值可達1.592%。

考慮到實際情況，將最佳條件修正為提取時間37min，提取溫度82℃，料液比1:26，RFDP的提取得率為：1.585%。

4結(jié)論

本實驗以水為溶劑，超聲波輔助提取玫瑰花渣多糖，探索了提取溫度、提取時間、液料比對玫瑰花渣多糖得率的影響，經(jīng)單因素和響應(yīng)面試驗，得出玫瑰花渣多糖的最佳工藝為: 提取溫度82 ℃、提取時間37min、液料比1:26(g/mL) ，玫瑰花渣多糖的得率為31.585%，與預(yù)測值1.592% 高度相符，并得到玫瑰花渣多糖得率與提取各因素變量的二次方程模型，該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好，說明模型方程能很好地反應(yīng)真實的試驗值，有一定應(yīng)用價值。

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(責(zé)任編輯：覃華巧)

Study of the Extraction Technique of Rose FlowerDreg Polysaccharide by Response Surface Methodology

Gou Mingjiang1, Xu Zijing2, Liu Qian3

(1.2. Center of Natural Products, Guizhou University of Engineering Science, Bijie 551700, China;3. Wuzhou University, Wuzhou 543002, China)

Optimization of technique of extracting polysaccharides from rose flower dregs by response surface methodology has been conducted. On the basis of single factor experiment, taking extraction temperature, extraction time and ratio of solid to liquid as factorial parameters, taking polysaccharide yield as the response value, employing Box-Behnken Design (BBD) and response surface methodology(RSM) of three-factor-three-level test，a mathematical regression model was established to study the interaction the variables and their impact on extracting rate of rose flower dreg polysaccharide. The results indicate importance of three process parameters affecting extraction yield of polysaccharides is in the ranking of extraction temperature, extraction time and ratio of solid to liquid. The optimum extraction conditions of polysaccharides from rose flower dregs are as follows: extraction temperature of 82℃, extraction time of 37minutes and ratio of solid to liquid of 1:26 (g/ml). The extraction yield of polysaccharides of rose flower dregs could be up to 1.585%, exhibiting a good agreement with the predicted values of 1.592%.

Rose flower dreg polysaccharides (RFDP); Response surface methodology (RSM); Extraction; Optimization

2016-09-26

貴州省科技廳、市科技局學(xué)校聯(lián)合基金(LH[2016]7059)；貴州省畢節(jié)市2016年科學(xué)發(fā)展計劃基金([2016]32)

TQ914.3

A

1673-8535(2016)06-0037-08

勾明江(1994-)，男，貴州畢節(jié)人，貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化工程學(xué)院本科生。

許子競(1970-)，男，江西臨川人，貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化工程學(xué)院天然產(chǎn)物中心副教授，研究方向：天然產(chǎn)物提取與分離。

劉茜(1975-)，女，廣西梧州人，梧州學(xué)院機化學(xué)院講師，研究方向：天然產(chǎn)物提取與分離。