周　磊，范茂丹，史承勇

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·論著·

高同型半胱氨酸血癥對大鼠頸總動脈平滑肌細(xì)胞增殖及Caspase-12蛋白表達(dá)的影響

周磊1，范茂丹1，史承勇2

[摘要]目的研究高同型半胱氨酸血癥對大鼠頸總動脈平滑肌細(xì)胞增殖及Caspase-12蛋白表達(dá)的影響。方法選取雄性SD大鼠40只，隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只。分別以不同劑量蛋氨酸飲食喂飼12周后分離頸總動脈。HE染色觀察頸總動脈增殖情況；利用免疫熒光染色法觀察并測定頸總動脈內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達(dá)情況；利用免疫組織化學(xué)染色法及蛋白免疫印跡法檢測Caspase-12蛋白表達(dá)情況。結(jié)果不同劑量蛋氨酸飲食導(dǎo)致大鼠頸總動脈不同程度增殖，頸總動脈內(nèi)PCNA、Caspase-12蛋白表達(dá)增加，并呈濃度依賴性。結(jié)論高同型半胱氨酸血癥通過激活血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致Caspase-12蛋白表達(dá)增加，加重血管損傷，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)一步加重動脈粥樣硬化。

[關(guān)鍵詞]同型半胱氨酸；平滑肌細(xì)胞；動脈粥樣硬化；Caspase-12

作者單位：1. 310002浙江杭州，南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院海勤療養(yǎng)區(qū)干部療養(yǎng)科；2. 310013浙江杭州，解放軍117醫(yī)院心血管內(nèi)科

引用格式：周磊，范茂丹，史承勇.高同型半胱氨酸血癥對大鼠頸總動脈平滑肌細(xì)胞增殖及Caspase-12蛋白表達(dá)的影響[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(1):21-24，46.

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是體內(nèi)正常蛋氨酸循環(huán)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物[1]。高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocystinemia, HHcy)是各種原因?qū)е碌牡鞍彼嵫h(huán)障礙，造成血漿中的Hcy水平>15 μmol/L[2]。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，Hcy是一種反應(yīng)性血管損傷氨基酸，HHcy與動脈粥樣硬化的形成發(fā)展密切相關(guān)[3]。血管平滑肌細(xì)胞的凋亡及異常增殖是動脈粥樣硬化形成的重要病理特征及主要發(fā)病過程。因此，本研究中利用喂飼SD大鼠不同劑量高蛋氨酸飲食建立高同型半胱氨酸血癥模型。在同一時(shí)間、同等條件下，利用免疫熒光染色法測定頸總動脈內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達(dá)情況，評估頸總動脈平滑肌細(xì)胞增殖狀態(tài)；利用免疫組織化學(xué)染色法及蛋白免疫印跡法檢測Caspase-12蛋白表達(dá)情況，旨在明確HHcy對頸總動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響，為探究HHcy引起動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制提供線索。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動物：成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(150±28)g，購于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SYXK(滬)2012-0003。建模過程中SD大鼠均清潔級飼養(yǎng)，定時(shí)喂食、喂水，室溫維持在22～24 ℃，每日8～22時(shí)光照。

實(shí)驗(yàn)試劑： Dako Denmark A/S抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒、PCNA抗體(購于上海谷歌生物有限公司),Caspase-12抗體(購于美國Biovision公司),BSA(購于Roche公司),肝素、水合氯醛、多聚甲醛、1%鹽酸酒精、PBS液等。

1.2高同型半胱氨酸血癥模型的建立及Hcy濃度的測定隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD大鼠分為4組，每組10只，各組大鼠鼠齡、體重均無顯著差異(P>0.05)。各組大鼠分別以不同劑量蛋氨酸飲食喂飼。對照組喂飼常規(guī)普通飼料，2%蛋氨酸組喂飼含2%蛋氨酸的高蛋氨酸飼料，4%蛋氨酸組喂飼含4%蛋氨酸的高蛋氨酸飼料，6%蛋氨酸組喂飼含6%蛋氨酸的高蛋氨酸飼料。各組大鼠分別于喂飼8、10、12周時(shí)抽取靜脈血，抗凝管收集，應(yīng)用美國貝克曼庫爾特AU 680型全自動生化分析儀檢測血漿Hcy濃度，計(jì)算3次測量值的平均值代表各組實(shí)驗(yàn)動物的血漿Hcy濃度。

1.3頸總動脈取材各組大鼠建模12周后取材：水合氯醛麻醉成功后將大鼠固定在操作臺上，常規(guī)備皮、消毒。取頸正中切口，鈍性分離皮下組織，暴露氣管，游離血管鞘，分離與左頸總動脈伴行的迷走神經(jīng)，以動脈夾孤立頸總動脈后剪下。用含肝素的生理鹽水沖洗3遍，將分離的頸總動脈以4%多聚甲醛固定24 h后常規(guī)石蠟切片。

1.4HE染色觀察頸總動脈增殖將已固定并包埋的頸總動脈石蠟切片脫蠟，蘇木素染色5 min，流水沖洗后以1%鹽酸酒精分化30 s，分化滿意后流水沖洗。1%氨水溶液返藍(lán)30 s，滿意后伊紅染色3 min，充分脫水后中性樹膠封片。

1.5免疫熒光染色法測定PCNA表達(dá)將已固定并包埋的頸總動脈血管組織石蠟切片放入65 ℃的烘箱中烘片脫蠟，PBS液沖洗后置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，冷卻后置入3%過氧化氫溶液，室溫孵育10 min后5% BSA封閉20 min，滴加1:200稀釋的兔源抗鼠PCNA單克隆抗體，4 ℃過夜，次日PBS液洗凈后，每張切片中加100 μL熒光素標(biāo)記驢抗兔IgG(Donkey Anti-rabbit/FITC抗體)，避光室溫下孵育1 h，PBS液洗凈后，每張切片中加入100 μL DAPI，避光細(xì)胞核染色5 min，用抗熒光淬滅封片劑封片，4 ℃下避光保存，用Bio-Red Radiance 2100型激光掃描共聚焦顯微鏡操作系統(tǒng)，氬離子激光系統(tǒng)掃描FITC標(biāo)記的陽性反應(yīng)物，陽性反應(yīng)物經(jīng)Laser Sharp2000軟件攝像分析。

1.6免疫組織化學(xué)染色法檢測Caspase-12蛋白表達(dá)將已固定并包埋的頸總動脈石蠟切片脫蠟至水洗，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶免疫組織化學(xué)方法(SABC)檢測Caspase-12蛋白，兔源抗鼠Caspase-12多克隆抗體用5%BSA抗體稀釋液按1∶100稀釋，4 ℃過夜；二抗用5%BSA抗體稀釋液按1∶2000稀釋，DAB顯色后復(fù)染、脫水、透明、封片。在光鏡下觀察Caspase-12蛋白陽性顆粒。

1.7蛋白免疫印跡法檢測Caspase-12蛋白表達(dá)將備用的頸總動脈血管組織液氮預(yù)冷后研磨成粉，含1%蛋白酶抑制劑的組織裂解液裂解，12 000 r/min離心并收集總蛋白提取液，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、浸泡、搖床，加入兔源抗鼠Caspase-12多克隆抗體(用5%BSA抗體稀釋液按1∶1000稀釋)后4 ℃過夜，二抗(用5%BSA抗體稀釋液按1∶1000稀釋)搖床雜交2 h，加顯色劑避光顯色5 min，終止反應(yīng)。將膠片掃描、存檔，凝膠成像分析儀分析處理，以β-actin作為內(nèi)參，以Caspase-12/β-actin積分光密度值的比值表示Caspase-12蛋白相對表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1各實(shí)驗(yàn)組血漿Hcy濃度各實(shí)驗(yàn)組分別于喂飼8、10、12周時(shí)抽取靜脈血檢測Hcy濃度，結(jié)果提示在不同劑量高蛋氨酸飲食喂飼12周后，2%、4%及6%蛋氨酸組大鼠分別出現(xiàn)不同程度的高同型半胱氨酸血癥，見表1。

組別nHcy濃度(μmol/L)對照組207.22±1.202%蛋氨酸組1017.23±3.25*4%蛋氨酸組1022.45±1.65*6%蛋氨酸組1027.32±3.02* 注:與對照組比較,*P<0.05

A:對照組;B:2%蛋氨酸組;C:4%蛋氨酸組;D:6%蛋氨酸組圖1　各組頸總動脈結(jié)構(gòu)(HE ×200)

2.2高同型半胱酸血癥對大鼠頸總動脈血管形態(tài)學(xué)的影響對照組大鼠頸總動脈壁各層結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜光滑，中膜血管平滑肌細(xì)胞排列整齊有序。2%蛋氨酸組、4%蛋氨酸組及6%蛋氨酸組大鼠頸總動脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜中平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的增殖，見圖1。

2.3高同型半胱酸血癥對大鼠頸總動脈血管壁PCNA表達(dá)的影響FITC免疫熒光染色后，頸總動脈中的PCNA呈現(xiàn)綠色信號。對照組大鼠頸總動脈內(nèi)PCNA綠色信號較少，2%、4%、6%蛋氨酸組大鼠頸總動脈內(nèi)PCNA綠色信號較對照組明顯增多，6%蛋氨酸組中PCNA綠色信號最多，見圖2。免疫熒光染色后，各組隨機(jī)選取10張圖片經(jīng)Laser Sharp2000軟件分析后，行熒光強(qiáng)度測定和PCNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果見表2。

表2　各組頸總動脈血管壁PCNA表達(dá)熒光強(qiáng)度

A:對照組;B:2%蛋氨酸組;C:4%蛋氨酸組;D:6%蛋氨酸組圖2　各組頸總動脈血管壁PCNA表達(dá)(FITC ×200)

A:對照組;B:2%蛋氨酸組;C:4%蛋氨酸組;D:6%蛋氨酸組圖3　免疫組織化學(xué)染色法檢測Caspase-12蛋白(SABC ×400)

2.4高同型半胱酸血癥對大鼠頸總動脈血管壁Caspase-12蛋白表達(dá)的影響免疫組織化學(xué)染色后，Caspase-12蛋白呈棕黃色顆粒，光鏡下觀察各組頸總動脈血管組織切片發(fā)現(xiàn)， 對照組大鼠頸總動脈血管組織中Caspase-12蛋白陽性顆粒較2%蛋氨酸組、4%蛋氨酸組及6%蛋氨酸組稀疏，染色較淡，6%蛋氨酸組中頸總動脈血管組織中Caspase-12蛋白陽性顆粒最為致密，且染色較深，見圖3。

Western blot檢測各組頸總動脈內(nèi)Caspase-12蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2%、4%、6%蛋氨酸組Caspase-12蛋白表達(dá)較對照組明顯增多，6%蛋氨酸組中Caspase-12蛋白表達(dá)最多，并且與Hcy呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖4。

與對照組比較，*P<0.05圖4　Western blot檢測Caspase-12蛋白結(jié)果及表達(dá)

3討論

高同型半胱氨酸血癥是以血漿Hcy水平異常增高為特征的病理狀態(tài)[4-5]，是動脈粥樣硬化形成前的亞臨床狀態(tài)。異常增高的Hcy是引起動脈粥樣硬化的新的、獨(dú)立的、重要的危險(xiǎn)因素[6-7]，可以視為高血壓、高血糖、脂代謝異常、吸煙等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素之外的心血管病剩留危險(xiǎn)因素。目前，Hcy對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響的實(shí)驗(yàn)研究主要基于離體實(shí)驗(yàn)，而離體細(xì)胞培養(yǎng)不能完全復(fù)制Hcy在體內(nèi)的代謝及病理生理過程。本研究中，筆者利用喂飼高蛋氨酸飲食的方法，使2%蛋氨酸組、4%蛋氨酸組及6%蛋氨酸組大鼠在不同劑量高蛋氨酸飲食喂飼12周后，血漿中Hcy水平均處于不同程度高水平狀態(tài)(均>15 μmol/L)，因此，可以視為較理想、可靠的高同型半胱氨酸血癥動物模型。

周憲梁等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，Hcy能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞cyclin D1的mRNA表達(dá)增加，通過細(xì)胞周期調(diào)控蛋白誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞進(jìn)入分裂期，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，這與本研究的結(jié)果相似。本研究中，2%、4%及6%蛋氨酸組大鼠頸總動脈中PCNA表達(dá)較對照組明顯增多，提示Hcy對血管平滑肌細(xì)胞具有明顯的增殖效應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy水平升高，PCNA的表達(dá)也相應(yīng)增多，說明Hcy并呈濃度依賴性刺激平滑肌細(xì)胞增殖。

血管平滑肌細(xì)胞的凋亡及異常增殖是動脈粥樣硬化形成的重要病理特征及主要發(fā)病過程。Caspase家族蛋白是一組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，參與多種凋亡途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9-11]。Caspase-12蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)凋亡的關(guān)鍵酶，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)特有的凋亡途徑[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-12過表達(dá)參與動脈粥樣硬化、糖尿病腎病、肝纖維化等多種疾病的發(fā)病過程[14-15]。本研究中，Caspase-12蛋白在各實(shí)驗(yàn)組中均有表達(dá)，2%、4%及6%蛋氨酸組中Caspase-12蛋白表達(dá)水平較對照組明顯升高。此外，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2%、4%及6%蛋氨酸組中Caspase-12蛋白表達(dá)水平較對照組明顯升高，并且與Hcy呈濃度依賴性。以上實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平及分子水平均證明了Caspase-12蛋白表達(dá)升高與血漿Hcy水平升高有關(guān)，并且與Hcy呈濃度依賴性。目前國內(nèi)外亦有研究發(fā)現(xiàn)，各種原因誘發(fā)的短時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，促使細(xì)胞生存的作用[16]。過強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)超過自身調(diào)節(jié)能力，會引起細(xì)胞功能紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及異常增殖[17]。本研究結(jié)果提示長時(shí)間高濃度的Hcy刺激可能造成Caspase-12蛋白表達(dá)增加，破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞凋亡及異常增殖。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)提示Caspase-12蛋白可能參與了HHcy引起的動脈粥樣硬化，Hcy可能激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，造成Caspase-12蛋白表達(dá)增加，進(jìn)一步激活下游Caspase凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，啟動平滑肌細(xì)胞凋亡，持續(xù)長時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)最終造成細(xì)胞功能紊亂，加速細(xì)胞凋亡，使血管平滑肌細(xì)胞異常增殖，最終參與并促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。Caspase-12蛋白參與的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是Hcy導(dǎo)致動脈粥樣硬化可能的機(jī)制之一。

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(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

Effect ofhyperhomocystinemia on the proliferation of rats common carotid artery vascular smooth muscle cells and expression of Caspase-12

ZHOULei1,FANMao-dan1,SHICheng-yong2

.1.DepartmentofConvalescent,NavalLogisticsBranchofHangzhouSanatorium,NanjingMilitaryCommand，Hangzhou,Zhejiang310002,China；2.DepartmentofCardiology, 117HospitalofPLA,Hangzhou,Zhejiang310013,China

[Abstract]ObjectiveTo test the effect of hyperhomocystinemia on the proliferation of rats carotid artery vascular smooth muscle cells and the expression of Caspase-12. MethodsForty male SD rats were divided into four groups randomly. The common carotid artery were separated after feeding with high methionine foods for three months and taken to HE staining for observing the proliferation of carotid arteries. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was detected by immunofluorescence staining. The expression of Caspase-12 was tested by immunohistochemistry and Western blot. ResultsDifferent levels of methionine in the diet leaded to varying degrees of proliferation of common carotid artery smooth muscle cells and increased expression of PCNA and Caspase-12 in a dose-dependent manner. ConclusionHyperhomocysteinemia can lead to increased expression of Caspase-12, which aggravates vascular injury through activation of endoplasmic reticulum stress response, promotes smooth muscle cell proliferation and further leads to atherosclerosis.

[Key words]homocysteine; smooth muscle cell; atherosclerosis; Caspase-12

(收稿日期：2015-08-24；修回日期：2015-10-19)

通訊作者：史承勇，E-mail：3177318463@qq.com

[中圖分類號]R543

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.006