小鼠非手術(shù)胚胎移植方法

小鼠作為發(fā)育和生殖生物學(xué)研究中最常見的模式動(dòng)物，其研究的主要環(huán)節(jié)離不開胚胎移植技術(shù)。小鼠非手術(shù)胚胎移植法是將供體小鼠的胚胎經(jīng)子宮頸移植到受體小鼠子宮內(nèi)的一種移植方法。它與手術(shù)法相比，簡單快捷，對小鼠的損傷小，大大簡化了胚胎移植的操作過程。早在1951年，R. A.Beatty首先對動(dòng)物非手術(shù)胚胎移植法進(jìn)行了報(bào)道，隨后 L.Marsk、T. Davis、F.A.Van der Hoeven等也相繼對非手術(shù)胚胎移植法進(jìn)行了研究，但直到1964年才正式應(yīng)用非手術(shù)胚胎移殖技術(shù)，但主要還是以牛的胚胎移植為主，本文主要介紹了小鼠非手術(shù)胚胎移植的整個(gè)過程，讓我們對非手術(shù)胚胎移植方法有一個(gè)基本的認(rèn)識(shí)。

1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1 供試小鼠。試驗(yàn)所用小鼠為6～8周齡的CD-1品系小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)動(dòng)物房保持溫度為22℃～25℃，濕度為50%～60%，采用12L∶12D的循環(huán)光照制度。試驗(yàn)小鼠飼喂商業(yè)購買的小鼠普通繁殖飼料，均為自由采食飲水，試驗(yàn)動(dòng)物房由專人清潔打掃，保證環(huán)境的清潔衛(wèi)生。試驗(yàn)的所有操作均獲河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)許可，符合動(dòng)物試驗(yàn)的3R原則。

1.2 胚胎與受體準(zhǔn)備。將自然發(fā)情的母鼠按1∶1的比例與正常公鼠合籠，第二天清晨觀察母鼠陰道栓來確定是否交配，見栓即作為供體小鼠，記為見栓0.5 d。見栓3.5 d時(shí)，用頸部脫臼法處死小鼠，剪下小鼠的子宮放到盛有M2操作液的培養(yǎng)皿中，由宮管結(jié)合部靠近子宮角側(cè)剪斷子宮，用注射器吸取M2操作液從子宮頸端沖出囊胚。在體視顯微鏡下用口吸管將形態(tài)正常的囊胚依次轉(zhuǎn)移到幾滴大小均勻的M2操作液滴中洗滌干凈，待后續(xù)試驗(yàn)。

挑選發(fā)情狀況良好的母鼠與結(jié)扎公鼠合籠，如果結(jié)扎公鼠的數(shù)目有限，可按1∶2合籠(即一只公鼠與兩只母鼠合籠)，合籠的第二天清晨檢查陰道栓，見栓的母鼠記為假孕0.5 d。依次類推至假孕2.5 d，即可進(jìn)行非手術(shù)胚胎移植。假孕的母鼠在移植前注射1.25%的阿佛丁進(jìn)行麻醉(每克體重0.02 ml)，每只母鼠移植囊胚6～10枚，分娩后記錄活仔數(shù)以待分析。

1.3 移植器械的制備

1.3.1 玻璃導(dǎo)管的制備。玻璃管在酒精燈火焰上輕烤使之軟化，離開火焰迅速用鑷子拉伸玻璃管，最終制備的玻璃毛細(xì)管外徑約為0.6 mm，內(nèi)徑約為0.4 mm，將玻璃細(xì)管插入10 μl的槍頭中，并在二者接合處套上長度約為5 mm的膠管(內(nèi)徑為0.79 mm，外徑為2.38 mm)，以保證器械的密封性。從膠管處開始測量玻璃管的長度，長度約為25 mm；若玻璃管過長，則用砂輪截取合適長度，然后將玻璃管尖端與酒精燈火焰短暫接觸，使末端鈍圓，以減少胚胎移植過程中由器械造成的子宮損傷。最后將制備好的玻璃針高壓滅菌(121℃，15 min)，放置于60℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干后備用。

1.3.2 非手術(shù)移植器械PTFE管的制備。將10 μl的槍頭與外徑0.6 mm、內(nèi)徑0.3 mm的聚四氟乙烯(PTFE)管(Model 30 L，深圳沃爾)組裝，露出長度約為25mm，PTFE管與10 μl槍頭的接合處用熱縮管(φ0.6 RSFR-125H，深圳沃爾)固定。從熱縮管端開始測量PTFE管的長度，分別截取1.5 cm、2.0 cm、2.5 cm，然后在酒精燈下將PTFE管與酒精燈火焰短暫接觸，使末端鈍圓。將制備好的非手術(shù)移植器械高壓滅菌(121℃，15 min)，并在60℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干后備用。最后將直徑為4 mm的醫(yī)用聚乙烯管截成10 mm的小段，作為小鼠開膣管，然后在酒精燈下將管斷端燒烤圓滑無毛刺，以避免劃傷小鼠陰道。

2 移植過程

2.1 胚胎的吸取。在60 mm的培養(yǎng)皿中做一個(gè)40 μl的M2液滴，每滴放入6～10枚囊胚，將移液器量程調(diào)至1.5 μl，然后將移液器吸頭與非手術(shù)移植器械牢固接合，移液器控制按鈕按到第一個(gè)停點(diǎn)，將PTFE管傾斜至M2液滴中，首先吸取長度約為5 mm的M2液柱。然后，在體視顯微鏡下將囊胚全部吸入管中，如果第一次吸入失敗，可將已吸入的囊胚及M2液體打出，并更換移植器械，準(zhǔn)備第二次吸入胚胎，因?yàn)槌睗竦囊浦补芎茈y再次吸入胚胎。胚胎吸入移植管后，將移液器放到架子上，保證管頭不要碰到任何東西，等待移植。

2.2 移植過程

2.2.1 假孕小鼠腹腔注射1.25%的阿佛丁進(jìn)行麻醉(每克體重0.02 ml)。

2.2.2 將假孕鼠置于鼠籠籠蓋上，使其前爪緊抓住籠蓋，用拇指和食指抓住小鼠尾根部輕輕提起，其余三指向下按壓小鼠背部，將其固定。

2.2.3 將直徑為4 mm的開膣器插入小鼠陰道底部，在冷光源下觀察暴露的子宮頸口。

2.2.4 將吸有胚胎的移植管插入子宮頸口，沿子宮頸口緩慢推進(jìn)移植管進(jìn)入小鼠的一側(cè)子宮角，推進(jìn)過程中旋轉(zhuǎn)移液器和移植導(dǎo)管，讓移植導(dǎo)管彎曲的方向和小鼠子宮頸延伸的方向保持一致，若無法進(jìn)入則立即將移植管退出，并在體視顯微鏡下觀察胚胎是否丟失，管口是否堵塞，然后重新移植。當(dāng)移植導(dǎo)管上的熱縮管到達(dá)子宮頸口時(shí)，按壓移液器到第一停點(diǎn)，將胚胎移入子宮內(nèi)。移植后邊旋轉(zhuǎn)邊緩慢退出移植導(dǎo)管約5 mm，然后將移植導(dǎo)管與移液器分離，注意不要旋轉(zhuǎn)移植管，緩慢拔出移植導(dǎo)管并觀察導(dǎo)管中是否有液體殘留。

2.2.5 取出開膣管，將假孕小鼠放回籠中。

總之，小鼠非手術(shù)胚胎移植相對于手術(shù)法更符合動(dòng)物福利原則，而且術(shù)后不易感染，是未來研究的熱門課題。

[1]GreenM，BassS，SpearB.A device for the simple and rapidtranscervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications[J].BioTechniques，2009，47(05)：919～924.

[2]Beatty R.A.Transplantation of mouse eggs[J]. Nature，1951，168(4284)：995.

[3]MarskL，LarssonKS.A simple method for nonsurgical blastocyst transfer in mice[J].Journal of reproduction and fertility，1974，37(02)：393～398.

[4]OrtizME，LladosC，CroxattoHB.Embryos of different ages transferred to the rat oviduct enter the uterus at differenttimes[J].Biology of Reproduction，1989，41(03)：381～384.

071000 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 蔣 瑞 岳巧嫻 王澤偉

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目：小鼠非手術(shù)胚胎移植器的研究(20160403)