田代雄

(湖北省恩施州中心醫(yī)院燒傷整形科，湖北 恩施　445000)

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不同人工真皮支架對(duì)Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)中組織TGF-β1和細(xì)胞凋亡的影響

田代雄

(湖北省恩施州中心醫(yī)院燒傷整形科，湖北 恩施445000)

摘要：目的探討不同人工真皮支架對(duì)Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)中組織TGF-β1和細(xì)胞凋亡的影響。方法隨機(jī)將12只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成2組每組6只，A組為膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架組；B組為負(fù)載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架組。C組為在A、B兩組中各取3只豬，在背部制備同2組相同的燒傷創(chuàng)面，只植入硅橡膠膜。比較3組間創(chuàng)面修復(fù)情況，創(chuàng)面中表達(dá)α-SMA、TGF-β1的情況以及細(xì)胞凋亡數(shù)。結(jié)果B組負(fù)載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架與創(chuàng)面的整合和恢復(fù)均較好于A、C組。1～3周3組創(chuàng)面α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管逐漸增多。C組在1～4周內(nèi)α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。B組在1～3周內(nèi)α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管數(shù)均顯著多于A組(P<0.05)。第2周3組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)比第1周顯著增多。植皮后A、B組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)均有降低。A、B兩組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)均成先上升后下降的趨勢(shì)，其中2周TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)表達(dá)最高。C組3、4周創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)均顯著多于A、B組(P<0.05)。1～4周，3組創(chuàng)面的細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增加。在不同時(shí)一間點(diǎn)，A組與B組的細(xì)胞凋亡數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在不同時(shí)一間點(diǎn)，C組的細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。結(jié)論負(fù)載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架在Ⅲ度燒傷創(chuàng)中可促進(jìn)血管生成，有效抑制創(chuàng)面收縮同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少瘢痕的增生。

關(guān)鍵詞:人工真皮支架；創(chuàng)面修復(fù)；TGF-β1；細(xì)胞凋亡

燒傷造成大面積組織暴露于外部環(huán)境，易造成肢體感染甚至功能喪失[1]。每年我國(guó)有100余萬(wàn)人因燒傷需進(jìn)行皮膚缺損的救治[2]。自體皮膚移植目前仍然是治療皮膚缺損的首選方法[3]。然而對(duì)于大面積燒傷患者存在供皮不足的問(wèn)題。隨著材料學(xué)、再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，已有模擬人體皮膚的人工真皮支架[4]。本研究考察負(fù)載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架和膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架在Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：廣西巴馬小香豬12只，雌性，體質(zhì)量(10±2)kg。主要材料：膠原—磺化羧甲基殼聚糖/硅橡膠雙層人工皮膚(三維多孔結(jié)構(gòu)，孔徑80～500 μm，厚度2 mm，直徑3.2 cm，孔隙率>90%)。VEGF DNA質(zhì)粒(購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué))，醫(yī)用級(jí)硅橡膠薄膜；α-SMA(α-平滑肌肌動(dòng)蛋白)單克隆抗體；TGF-β1(細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子)單克隆抗體；SP免疫組化檢測(cè)試劑盒。

1.2方法分組：隨機(jī)將12只豬分成2組每組6只，A組為膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架組；B組為負(fù)載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架組。每只豬于背部行Ⅲ度燒傷創(chuàng)面模型制作[5-8](速眠新Ⅱ肌肉注射和3%戊巴比妥腹腔注射復(fù)合麻醉。將溫度為100℃、直徑2.5 cm的銅塊在豬背部?jī)蓚?cè)距離后正中線(xiàn)3～ 4 cm處恒溫恒壓持續(xù)70 s，造成Ⅲ度燒傷。每次制備2～4個(gè)創(chuàng)面，每次常規(guī)清創(chuàng)后聚維酮碘包扎。每日換藥一次)。C組：在A、B兩組中各取3只豬，在背部制備同2組相同的燒傷創(chuàng)面，只植入硅橡膠膜。

取材：對(duì)3組在不同支架移植術(shù)后1、2、3周打開(kāi)內(nèi)層敷料，揭下硅橡膠膜，觀察創(chuàng)面，在創(chuàng)面中間切取大小為0.5 cm×0.5 cm深至肌層的組織塊，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)12孔。

表皮移植：剪大小為(0.5～0.6)cm ×(0.5～0.6)cm的豬刃厚皮，置于0.2%胰酶緩沖液中，37℃下消化1.2 h,將表皮從組織剝離下來(lái)。在植入支架2周后，揭下硅橡膠膜，植入分離的表皮，常規(guī)加壓固定。2周后進(jìn)行創(chuàng)面組織學(xué)研究。

免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)：對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)，3組每12個(gè)標(biāo)本其中6個(gè)進(jìn)行α-SMA陽(yáng)性檢測(cè)(SP法，一抗?jié)舛葹?∶200，PBS為陰性對(duì)照。陽(yáng)性信號(hào)為棕色或黃色)；另6個(gè)標(biāo)本進(jìn)行TGF-β1檢測(cè)(TGF-β1一抗?jié)舛葹?∶200，二甲氨偶氮苯(DAB) 顯色，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色)。均在400×光鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，陽(yáng)性主要在血管和創(chuàng)面肌成纖維細(xì)胞漿表達(dá)，對(duì)表達(dá)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

TUNEL檢測(cè)(組織細(xì)胞凋亡檢測(cè))：按檢測(cè)試劑盒步驟操作(反應(yīng)液中不加TdT酶為陰性對(duì)照，陽(yáng)性信號(hào)為棕色或黃色，在細(xì)胞核表達(dá))。標(biāo)本觀察同免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)光鏡觀察。

2結(jié)果

2.1創(chuàng)面觀察1～3周，B組創(chuàng)面由黃白色未血管化基本轉(zhuǎn)為紅潤(rùn)色；A組創(chuàng)面由黃白色未血管化轉(zhuǎn)為紅潤(rùn)色，但仍有部分未血管化的黃白色真皮支架；C組燒傷面由較多分泌物轉(zhuǎn)為少量分泌，創(chuàng)面粗糙。總之，在不同時(shí)間點(diǎn)，B組負(fù)載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化梭甲基殼聚糖人工真皮支架與創(chuàng)面的整合和恢復(fù)均較好于A、C組。

2.23組創(chuàng)面α-SMA陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)情況3組創(chuàng)面的α-SMA陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)見(jiàn)圖1。在不同人工支架植入2周后，A組可見(jiàn)血管和肌成纖維細(xì)胞的生成；B組血管表達(dá)量多于A組，肌成纖維細(xì)胞表達(dá)少于A組；C組血管表達(dá)量較A、B組少，肌成纖維細(xì)胞表達(dá)多于A和B組。

圖1　3組創(chuàng)面2周后α-SMA陽(yáng)性信號(hào)

由表1、圖2可知，1～3周3組創(chuàng)面α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管逐漸增多。C組在1～4周內(nèi)α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。第4周B組α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管數(shù)與A組無(wú)顯著差異(P>0.05)。B組在1～3周內(nèi)α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管數(shù)均顯著多于A組(P<0.05)。

2.33組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)情況比較由表2、圖3可知，第2周3組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)數(shù)比第1周顯著增多。植皮后A、B組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)數(shù)均有降低。A、B兩組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)數(shù)均成先上升后下降的趨勢(shì)，其中2周TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)數(shù)最高。兩組各周時(shí)間點(diǎn)下，創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。C組3、4周創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)數(shù)均顯著多于A、B組(P<0.05)。

2.43組創(chuàng)面細(xì)胞凋亡比較由表3、圖4可知，1～4周，3組創(chuàng)面的細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增加。在不同時(shí)間點(diǎn)，A組與B組的細(xì)胞凋亡數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在不同時(shí)間點(diǎn)，C組的細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。

組別1周2周3周4周A組14.6±2.7#22.4±2.8#37.5±3.1#26.4±2.6#B組24.3±3.1*35.2±4.1*40.2±4.6*26.3±2.4C組4.7±2.111.6±3.318.6±2.815.8±3.5

注：*與A、C組相比，P<0.05；#與C組相比，P<0.05。

組別1周2周3周4周A組166.4±17.3203.5±24.8#129.2±30.167.4±15.3B組185.1±9.5228.5±23.4#110.6±28.255.8±11.4C組98.5±18.5*149.6±18.3*#202.4±13.6*170.3±21.2*

注：*與A、B組相比，P<0.05；#與1周相比，P<0.05。

組別1周2周3周4周A組3.5±2.717.8±4.6a52.3±6.6b79.2±16.2cB組4.2±2.219.3±5.1a55.5±7.4b79.4±17.1cC組3.2±2.2*5.3±2.7*10.8±4.5*18.5±3.6*

注：*與A、B組相比，P<0.05；a與1周相比，P<0.05；b與1周相比，P<0.05；c與1周相比，P<0.05。

3討論

每年有很多人因?yàn)闊齻斐善つw缺損。皮膚缺損對(duì)患者的生活甚至生命健康帶來(lái)很大的影響[8]。目前，自體皮膚移植仍然是治療皮膚缺損的首選方法。臨床治療過(guò)程中往往存在供體不足的情況。近年來(lái)材料學(xué)、再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，已有模擬人體皮膚的人工真皮支架[9]。然而，人工真皮支架能否與創(chuàng)傷面的完美整合一直是研究的熱點(diǎn)。VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管的生成。據(jù)報(bào)道[10-11]，負(fù)載VEGF的人工真皮支架能催進(jìn)血管的形成，有利于與創(chuàng)面的整合。本研究考察負(fù)載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架和膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架在Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用效果。

通過(guò)檢測(cè)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)可判斷新生血管的成熟水平。因?yàn)棣?SMA是新生血管的標(biāo)志物，主要在血管和創(chuàng)面肌成纖維細(xì)胞漿中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，1～3周3組創(chuàng)面α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管逐漸增多。C組在1～4周內(nèi)α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。第4周B組α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管數(shù)與A組無(wú)顯著差異(P>0.05)。B組在1～3周內(nèi)α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的血管數(shù)均顯著多于A組(P<0.05)。結(jié)合創(chuàng)面狀態(tài)觀察，B組創(chuàng)面由黃白色未血管化基本轉(zhuǎn)為紅潤(rùn)色；A組創(chuàng)面由黃白色未血管化轉(zhuǎn)為紅潤(rùn)色，但仍有部分未血管化的黃白色真皮支架；C組燒傷面由較多分泌物轉(zhuǎn)為少量分泌，創(chuàng)面粗糙。說(shuō)明負(fù)載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架誘導(dǎo)血管的生成，催進(jìn)了膠原的產(chǎn)生，與創(chuàng)面整合度較高，可維持3周。

實(shí)驗(yàn)中植入2周3組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)比第1周顯著增多。植皮后A、B組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)均有降低。A、B兩組創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)均成先上升后下降的趨勢(shì)，其中2周TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)表達(dá)最高。兩組各周時(shí)間點(diǎn)下，創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。C組3、4周創(chuàng)面TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)數(shù)均顯著多于A、B組(P<0.05)。VEGF誘導(dǎo)血管化促進(jìn)了TGF-β1的表達(dá)。然而，TGF-β1與創(chuàng)面修復(fù)和瘢痕的增生密切相關(guān)的細(xì)胞因子。既可促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原，有利于創(chuàng)面的修復(fù)，同時(shí)也可以通過(guò)調(diào)控膠原、蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促使瘢痕生成[12-13]。1～2周表達(dá)較高，催進(jìn)了纖維細(xì)胞的合成，創(chuàng)面的恢復(fù)。3～4周表達(dá)降低，降低了膠原的沉積，減少了瘢痕的增生。

通過(guò)TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1～4周3組創(chuàng)面的細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增加。在不同時(shí)間點(diǎn)，A組與B組的細(xì)胞凋亡數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在不同時(shí)間點(diǎn)，C組的細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著少于A、B組(P<0.05)。有報(bào)道稱(chēng)[14-15]，細(xì)胞的凋亡同樣是抑制瘢痕增生和收縮的主要原因。說(shuō)明支架組早期伴隨著細(xì)胞的增殖，同時(shí)出現(xiàn)了大批血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而減少了瘢痕的增生。

綜上所述，負(fù)載VEGF DNA質(zhì)粒的膠原—磺化羧甲基殼聚糖人工真皮支架在Ⅲ度燒傷創(chuàng)中可促進(jìn)血管生成，有效抑制創(chuàng)面收縮同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少瘢痕的增生。

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Effect of different artificial dermal stents on the TGF- beta 1

and apoptosis in the tissue of third degree burn wounds

TIAN Dai-xiong

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,EnshiCentralHospital,Enshi，Hubei445000,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of different artificial dermal stents on the TGF- beta 1 and apoptosis in the tissue of third degree burn wounds.Methods Twelve pigs were randamized into 2 groups with 6 in each group, group A for collagen sulfonated carboxymethyl chitosan artificial dermal stent group and group B for artificial dermal stent of collagen sulfonated carboxymethyl chitosan encoded with VEGF DNA plasmid group. Three pigs from group A and group B respectively were assigned in group C with the same burn wounds on the back as in group A and B, implanted with only silicone rubber membranes. We compared the wound healing among the 3 groups, including the expression of α-SMA, TGF-β1 and apoptosis. Results The artificial dermal stent and wound healing in group B were better than those in group A and group C.During week 1 and 3, α-SMA positive vessels gradually increased in all three groups. The number of blood vessels in group C was significantly fewer than that in group A and B in 1～4 weeks, and the number of blood vessels in group B was significantly more than that in group A in 1～3 weeks (P<0.05).The number of TGF- beta 1 positive signal in the 3rd week was significantly increased more than that in the first week. TGF- beta 1 positive signals were reduced in both group A and B after skin grafting. The number of TGF- beta 1 positive signal in both group A and B tended to decrease after its increase, which reached the highest in the second week.The number of positive signals of TGF- beta 1 in group C at 3 and 4 weeks was significantly more than that in group A and B (P<0.05). During 1～4 week, the number of apoptotic cells in the 3 groups increased gradually. There was no significant difference in apoptosis at different time between group A and group B (P>0.05), while the number of apoptotic cells in group C was significantly lower than that in group A or group B(P<0.05). Conclusions Artificial dermal stent of collagen sulfonated carboxymethyl chitosan encoded with VEGF DNA plasmid for III degree burn wound can promote angiogenesis, inhibit wound contraction, promote cell apoptosis and reduce scar hyperplasia.

Key words:artificial dermal stent;wound repair;TGF- beta 1;apoptosis

收稿日期：(2015-08-17，修回日期：2015-10-23)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.024