況作品，周亞菁，謝曉梅，查日維，楊　沫

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥　230012)

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高效液相色譜法測定木瓜水溶性有機酸含量的樣品處理方法研究

況作品，周亞菁，謝曉梅，查日維，楊沫

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012)

摘要：目的優(yōu)化木瓜水溶性有機酸含量測定的樣品處理方法。方法采用經(jīng)驗證的高效液相色譜法，以蘋果酸、莽草酸、綠原酸、原兒茶酸、奎尼酸、咖啡酸含量為評判指標，用單因素試驗法考察提取方式(回流和超聲提取)，乙醇濃度和料液比對有機酸提取量的影響；提取后經(jīng)凈化、富集；用流動相中的水相溶解、進樣分析。結(jié)果樣品最佳處理方法為50%乙醇、料液比為1∶20、超聲提取60 min；在此條件下，木瓜有機酸提取量較高，非酸性成分干擾較少。色譜圖基線平直，6種水溶性有機酸的色譜峰對稱性和分離度良好。結(jié)論該方法能有效提取樣品中水溶性有機酸，降低HPLC分析中的基質(zhì)效應(yīng)，可為木瓜有機酸含量測定提供穩(wěn)定可靠的供試品溶液制備方法。

關(guān)鍵詞：木瓜；有機酸；樣品處理；測定；高效液相色譜法

中藥木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai的干燥近成熟果實，歸肝、脾經(jīng)，具有舒筋活絡(luò)，和胃化濕的功效[1]。木瓜中含有豐富的有機酸成分，傳統(tǒng)評價藥用品質(zhì)的標準是“味酸者為佳”[2]。藥理學研究表明有機酸藥理作用廣泛，是抗炎鎮(zhèn)痛、抑制血小板聚集、抗血栓及誘導腫瘤細胞凋亡的活性成分[3-5]。木瓜有機酸成分群含有脂溶性和水溶性有機酸[6]。脂溶性的三萜酸測定有較多文獻報道，齊墩果酸和熊果酸已被《中國藥典》收載為木瓜含量測定項下的指標成分[1]；但作為木瓜有機酸重要組成部分的水溶性有機酸測定的文獻較少，未見樣品中6種水溶性有機酸能同時被檢測到的報道[7-8]。有機酸成分的測量方法有氣相色譜法、液相色譜法和毛細管電泳法以及與質(zhì)譜聯(lián)用等方法。氣相色譜法一般需要將有機酸衍生化方可分離檢測[9]。HPLC法可用離子交換色譜和反相色譜分離[10-12]；但色譜圖峰形和分離度常不理想[13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，木瓜水溶性有機酸組成的類別較為復雜，有一元酸和多元酸，脂肪酸和芳香酸；且含量高低差別較大；因為水溶性，在提取時共存的干擾物較多；采用HPLC法測量的主要困難在樣品前處理和液相色譜分離條件選擇上。本文對木瓜中有機酸測定的樣品前處理進行了單因素試驗，利用已建的反相液相色譜法，以蘋果酸、莽草酸、原兒茶酸、綠原酸、奎尼酸、咖啡酸含量為評判指標，考察提取方式、乙醇濃度和料液比對有機酸提取量的影響；采用溶劑萃取對提取物凈化、富集；用酸化水溶解萃取物。旨在為木瓜中水溶性有機酸成分分析提供有效的樣品處理方法。

1儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀(包括G1312C二元泵，G1316B二極管陣列檢測器，G1316A柱溫箱和 chemstation色譜工作站)；BP211D電子天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；pHS-3CA精密酸度計(上海大普儀器有限公司)；Milli-QAdvantage超純水機(美國Millipore公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

奎尼酸(批號：130509，四川維克奇生物科技有限公司)、蘋果酸(批號 ：20120201，國藥集團化學試劑有限公司)和莽草酸(批號：15-2001，上海中藥標準化研究中心)的純度>98%，原兒茶酸(批號 ：110809-200604)、綠原酸(批號：110753-200413)和咖啡酸(批號 ：110885-200102)由中國食品藥品檢定研究院提供，均為含量測定用。乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。宣木瓜采自安徽宣城宣木瓜產(chǎn)地，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學藥學院彭華勝教授鑒定為Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai果實。用前干燥、粉碎(過40目篩)備用。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備精密稱取奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸對照品適量，用流動相A(0.5%磷酸二氫銨溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.2)溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為每1 mL含奎寧酸0.236 mg、蘋果酸0.630 mg、莽草酸0.226 mg、原兒茶酸0.254 mg、綠原酸0.214 mg、咖啡酸0.206 mg的對照品儲備液；分別精密量取1 mL儲備液置10 mL量瓶中，以流動相A稀釋至刻度，得混合對照品溶液。

2.2色譜條件[14-15]和系統(tǒng)適用性試驗色譜柱：Ultimate AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A：0.5%磷酸二氫銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.2)，流動相B：乙腈，梯度洗脫：0～7 min，100% A，7～15 min，100%～92% A，15～25 min，92% A，25～35 min，92%～85% A，35～40 min，85% A，40～45 min，85%A～100%A；檢測波長：0～7 min為210 nm，7～25 min為260 nm，25～45 min為325 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃?？崴?、蘋果酸、莽草酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.00之間，理論塔板數(shù)以蘋果酸計大于10 000。色譜圖見圖1。

混合對照品木瓜樣品

圖1 HPLC圖

注：1.奎尼酸 2.蘋果酸 3.莽草酸 4.原兒茶酸 5.綠原酸 6.咖啡酸。

2.3樣品處理試驗

2.3.1提取方式(1)超聲提取：取藥材粉末2.0 g，精密稱定，加30%乙醇20 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，鹽酸酸化至pH=2.0，再以等體積正丁醇萃取2次，合并萃取液，減壓回收溶劑，殘渣加流動相A溶解并定容至10 mL，濾過，得供試品溶液。平行2份。

(2)回流提取：取藥材粉末2.0 g，精密稱定，加30%乙醇20 mL，80℃水浴回流1 h，余下同“超聲提取”項下超聲提取法。平行2份。取對照品溶液和不同提取方式制得的供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣，外標法計算各有機酸含量，結(jié)果見圖2。顯示超聲提取方式較好。比較超聲30 min和60 min，顯示60 min 提取效果較好。

圖2　提取方式對木瓜有機酸提取量的影響

2.3.2乙醇濃度取藥材粉末2.0 g，精密稱定，分別精密加入水，10%乙醇，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇各20 mL，按“超聲提取”項下方法制備供試品溶液，各類溶劑平行2份。取對照品溶液和各供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣，外標法計算各有機酸含量，結(jié)果見圖3。顯示50%乙醇提取較好。

圖3　乙醇濃度對木瓜有機酸提取量的影響

2.3.3料液比取藥材粉末2.0 g，精密稱定，分別按料液比1∶8，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25精密加入50%乙醇，按“超聲提取”項下方法制備供試品溶液，每一料液比平行2份。取對照品溶液和各供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣，外標法計算各有機酸含量，結(jié)果見圖4。顯示1∶20料液比提取較好。

圖4　料液比對木瓜有機酸提取量的影響

依據(jù)木瓜水溶性有機酸提取條件試驗，確立最佳樣品處理方法為：取木瓜藥材粉末2.0 g，精密稱重，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇40 mL，超聲處理60 min，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，鹽酸酸化至pH = 2.0，加等體積正丁醇萃取2次，合并萃取液，減壓回收溶劑，殘渣加流動相A溶解并定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.4驗證性試驗取木瓜藥材粉末，按照最佳樣品處理方法制備供試品溶液，平行3份；取對照品溶液和各供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣，外標法計算各有機酸含量，結(jié)果見表1。

表1　木瓜水溶性有機酸提取方法

驗證性實驗結(jié)果表明，所建方法對6種脂肪族和芳香族有機酸測定的重復性良好，方法有效可行，適用于木瓜中這些水溶性有機酸HPLC測定的樣品處理。

3討論

本試驗中測定的水溶性有機酸奎尼酸(分子量192)、蘋果酸(分子量134)和莽草酸(分子量174)是脂肪酸，原兒茶酸(分子量154)、綠原酸(分子量354)和咖啡酸(分子量180)是酚酸；含量最高的是蘋果酸，約為最低含量咖啡酸的1 000倍。通過建立的樣品處理方法，結(jié)合對極性組分具有較強保留的AQ-C18色譜柱和波長切換技術(shù)，較好完成了在結(jié)構(gòu)和含量存在較大差異的木瓜6種水溶性有機酸成分群的同時測定。

由圖2～4可知，提取方式、乙醇濃度、料液比對木瓜中奎尼酸、蘋果酸、莽草酸提取量影響較大，對原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸影響較小。在提取方式上超聲比回流提取率高，原因可能是回流加熱過程導致部分有機酸被破壞；在提取溶劑甲醇或乙醇的使用上，考慮后續(xù)溶劑處理操作的安全性，選擇了毒性較小的乙醇；通過比較不同濃度乙醇提取與純水提取，發(fā)現(xiàn)這些水溶性有機酸在50%乙醇中被提取的更多。水溶性有機酸提取后，藥渣中仍存在一些非水溶性有機酸成分，合理利用藥渣也是對木瓜有機酸研究的重要部分。

實驗中分別考察了醇提取后堿化再酸化和醇提后直接酸化萃取對有機酸提取量的影響， 色譜分析結(jié)果顯示兩種方法的差異不明顯；但前者操作步驟較多，所得結(jié)果平行性較差，故采用醇提后直接酸化萃取的方法。在萃取溶劑種類上，分別考察了乙酸乙酯、正丁醇萃取對有機酸純化的影響，結(jié)果顯示有機溶劑萃取均起到凈化除雜和富集的作用，正丁醇萃取所得6種有機酸總含量明顯高于乙酸乙酯萃取。在萃取物溶解上，分別考察了甲醇、水和流動相A不同溶劑。結(jié)果顯示，以酸性電解質(zhì)水溶液為溶劑，對改善奎寧酸、蘋果酸、莽草酸的色譜峰峰形和分離度較為有利，6種水溶性有機酸得以很好的分離與測定。

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Sample processing method for determination of water soluble

organic acids in Chaenomelis Fructus by HPLC

KUANG Zuo-pin，ZHOU Ya-jing，XIE Xiao-mei，et al

(SchoolofPharmacy，AnhuiUniversityofChineseMedicine，

AnhuiKeyLaboratoryofModernChineseMateriaMedica，Hefei,Anhui230012，China)

Abstract:Objective To optimize the sample processing method for determination of water soluble organic acids in Chaenomelis Fructus by a validated HPLC-UV method. MethodsQuinic acid, malic acid, shikimic acid, protocatechuic acid, chlorogenic acid and caffeic acid were determined and used as an evaluation parameter.Single factor tests method was applied for evaluating the extraction(reflux and ultrasonic-assisted extraction), ethanol concentration and the effect of ratio of material to liquid on extraction of organic acids. The extracting solution with further purification and enrichment in mobile phase (A) employed were analyzed.ResultsThe optimum method was as follows: ratio of material to liquid 1:20 and ethanol concentration 50% with ultrasonic-assisted extraction for 60 min. Under optimal conditions, the high extraction efficiency of the organic acids in Chaenomelis Fructus was obtained with less interference from non-acidic components of the sample. A straight baseline, chromatographic peak symmetry and good resolution for the six kinds of water soluble organic acids were conducted in the chromatogram. ConclusionsThis sample processing method is effective, stable and reliable for extraction of water soluble organic acids in Chaenomelis Fructus, which can reduce the matrix effect significantly in the HPLC analysis.

Key words:Chaenomelis Fructus;organic acid;sample processing;determination;HPLC

收稿日期：(2015-08-14，修回日期：2015-11-09)

通信作者：謝曉梅，女，教授，碩士生導師，研究方向：中藥質(zhì)量分析研究，E-mail：xiexiaomei9401@sina.com

作者簡介：況作品，男，碩士研究生

基金項目：十二五國家科技支撐計劃(No 2011BAI04B06)；安徽高校省級自然科學研究項目(No KJ2012A188)；安徽中醫(yī)藥大學科研基金項目(No 2015zr009)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.015