盧麗琴，李　綱

(1.浙江省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州 310014；2.上海復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院閔行分院腫瘤科，上海 201100)

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·論著·

358例肺癌患者K-ras基因的突變分析

盧麗琴1，李綱2△

(1.浙江省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州 310014；2.上海復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院閔行分院腫瘤科，上海 201100)

摘要:目的分析358例肺癌患者K-ras基因突變的突變情況，為肺癌患者的個體化治療提供指導。方法通過嵌套和低變性溫度下的復合PCR(COLD-PCR)-測序法分析358例肺癌患者K-ras基因突變狀態(tài)。結果在358例肺癌患者中，K-ras基因總體突變率為8.10%。94份血漿標本、250份腫瘤組織標本、14份胸腔積液及腹水標本中的突變率分別為2.13%、9.60%、7.14%。突變類型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H，3種不同標本之間K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.064 8)；男性與女性患者的突變率分別為6.96%、8.59%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.574 0)；30～<45歲、45～<60歲、大于或等于60歲患者中的突變率分別為4.76%、5.34%、9.22%，不同年齡段患者K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.250 3)。結論肺癌患者K-ras基因突變類型主要為G12C、G12D、G12V、G13D，K-ras基因在不同標本類型、不同性別、不同年齡之間的突變率無明顯差異。

關鍵詞:肺癌；K-ras基因；基因突變狀態(tài)

世界衛(wèi)生組織2014年報告指出，癌癥是世界范圍內(nèi)導致死亡的首要原因，2012年有1 400萬新發(fā)癌癥病例，820萬人因癌癥死亡，新發(fā)病例數(shù)預計還將增加。2012年，男性發(fā)病率最高的是肺癌、前列腺癌、結直腸癌、胃癌和肝癌，女性發(fā)病率最高的是乳腺癌、結直腸癌、肺癌、宮頸癌和胃癌。肺癌是引起人類死亡最多的一種癌癥。世界新發(fā)病例中超過60%發(fā)生在非洲、亞洲和中南美洲，主要是由于吸煙、飲酒、不健康飲食和缺乏鍛煉所引起。

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，包括小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，后者占了80%，大部分確診的肺癌患者都處在晚期或已經(jīng)發(fā)生了轉移[1],化療是這部分患者可選的一種治療方法，但也只能增加幾個月的生存期[2]，表皮生長因子受體(EGFR)信號通路在細胞的增殖、生長、分化和遷移中發(fā)揮著重要的作用，這條通路的下游因子包括RAS/RAF/MAPK,編碼這條通路蛋白的基因突變可能都會影響到針對EGFR信號通路設計的靶向藥物的療效，因此，對這部分基因的檢測，就成為藥物能否使用的一個預測性生物標記物[3-6]。

1材料與方法

1.1標本來源358份臨床標本來自全國上百家三級醫(yī)院358例肺癌患者，包括94份血漿標本、250份組織標本和14份胸腔積液及腹水標本；其中來自男性230份，來自女性128份；來自30～<45歲患者21份，45～<60歲患者131份，≥60歲患者206份。所有參與本研究的肺癌患者或其家屬均簽署授權書，對上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司進行K-ras基因檢測知情同意。

1.2儀器與試劑離心機購自湘儀離心機儀器有限公司，PCR儀購自杭州博日科技有限公司，PCR產(chǎn)物序列測定由上海鼎安生物科技有限公司完成。DNA提取試劑盒購自Axygen Scientific Inc，Pfu酶購自上海申能博彩生物科技有限公司，dNTP購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3檢測方法(1)基因組DNA的提取按照試劑盒說明書進行。(2)低變性溫度下的復合PCR(COLD-PCR)-測序法檢測K-ras基因突變狀態(tài)。用primer 5進行引物設計，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，嵌套和COLD-PCR-測序法被用于檢測K-ras基因的突變。第1步進行 PCR擴增,常規(guī)PCR反應體系(10 μL)包括0.25 mmol/L的dNTP、0.5 μmol/L的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。PCR程序如下：95 ℃預變性3 min，接著進行32個擴增循環(huán)，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，然后72 ℃保持5 min。常規(guī)PCR方法被用于擴增465 bp的大片段。所用引物為：正向5′-GTC GAT GGA GGA GTT TGT AAA TGA AGT-3′和反向 5′-TTC AGA TAA CTT AAC TTT CAG CAT AAT TAT CTT G-3′。第2步進行COLD-PCR，COLD-PCR反應體系(50 μL)包括：0.25 mmol/L的dNTP、0.5 μmol/L的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和1 μL的大片段PCR產(chǎn)物。PCR程序如下：95 ℃預變性3 min；先進行40個擴增循環(huán)，80 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；隨后進行15個擴增循環(huán)，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；然后72 ℃，保持5 min。COLD-PCR方法用于擴增155 bp的小片段。所用引物為：正向5′-GTC ACA TTT TCA TTA TTT TTA TTA TAA GG-3′和反向5′-TTT ACC TCT ATT GTT GGA TCA TAT TC-3′。第3步進行PCR產(chǎn)物純化測序，由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1PCR產(chǎn)物測序結果采用COLD-PCR-測序法檢測K-ras基因突變狀態(tài)，其代表性結果見圖1，顯示肺癌患者K-ras基因第13位密碼子由GGC突變?yōu)镚AC。

2.2不同標本類型肺癌患者K-ras基因的突變情況本研究檢測了358例肺癌患者，K-ras基因總體突變率為8.10%。94份血漿標本的突變率為2.13%，250份組織標本的突變率為9.60%，14份胸腔積液及腹水標本的突變率為7.14%，突變類型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H，3種不同標本K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.064 8)，見表1。

圖1　　對COLD-PCR產(chǎn)物測序的代表性圖譜

2.3不同性別肺癌患者K-ras基因的突變情況K-ras基因在230例男性患者中的突變率為6.96%，突變類型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D，在128例女性患者中的突變率為8.59%，突變類型包括G12D、G12V、G13D、Q61H。不同性別K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.574 0)，見表1。

2.4不同年齡群體肺癌患者K-ras基因的突變情況K-ras基因在21例30～<45歲患者中的突變率為4.76%，突變類型為G13D，131例45～<60歲患者中的突變率為5.34%，突變類型包括G12C、G12D、G12V、G13D，206例大于或等于60歲患者中的突變率為9.22%，突變類型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H。不同年齡段患者K-ras基因的突變率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.250 3)，見表1。

表1　　采用COLD-PCR-測序法檢測肺癌患者K-ras基因的突變頻率[n(%)]

-：無數(shù)據(jù)。

3討論

循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是原發(fā)腫瘤轉移過程中釋放的中間產(chǎn)物，它有潛力為研究腫瘤的特征提供可用的生物活性物質，從而監(jiān)測腫瘤的治療，CTCs能從血液中富集，并通過CellSearch?系統(tǒng)進行計數(shù)，目前這種方法已經(jīng)被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于肺癌的相關檢測，判斷藥物反應和療效[7-9]。但是CTCs最大的問題是如何有效地富集血液中的腫瘤細胞，由于患者個體差異較大，血液成分異常復雜，所含腫瘤細胞的比例也有很大差異，研究出一種普遍適用又高效的富集方法成為大家研究的熱點。

肺癌患者化療后的癌轉移是影響患者生存的一個重要原因，目前有研究認為這種轉移是由于患者體內(nèi)還存在肺癌干細胞。如何識別、分離這些細胞，從而研究他們的遺傳和蛋白上的變化，開發(fā)出針對性的藥物成為將來研究的方向[10-11]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者存在致癌基因突變，且以一種互斥的方式存在，這些癌基因包括EGFR、Kras、ALK、MET等[12]。這些致癌基因的突變有些能預測小分子酪氨酸激酶抑制劑靶向療法的療效[13-14]。所以，在確定一種給藥方案前，往往要同時檢測幾個基因的突變情況。本研究發(fā)現(xiàn)在Kras第12位密碼子中存在4種突變，包括G12C、G12D、G12A、G12V，在第13位密碼子中也存在2種突變，包括G13D、Q61H，這些不同的突變對藥物的療效是否有不同的影響，雖然已經(jīng)有些研究[15]，但還需要更多證據(jù)的支持。

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Analysis of K-ras gene mutation in 358 cases of lung cancer

LuLiqin1,LiGang2△

(1.DepartmentofOncology,ZhejiangProvincialPeople′sHospital,Hangzhou,Zhejiang310014,China;2.Department

ofOncology,MinhangBranchHospital,AffiliatedTumorHospitalofFudanUniversity,Shanghai201100,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the mutation situation of K-ras gene in 358 cases of lung cancer to provide the guidance for the personalized therapy of lung cancer.MethodsThe nested and low denatured temperature compound PCR(COLD-PCR) method was used to analyze the K-ras mutations situation in 358 patients with lung cancer.ResultsIn 358 lung cancer patients,the total mutation frequency of K-ras gene was 8.10%.The mutation rates were 2.13% in 94 plasma samples,9.60% in 250 tumor tissue samples and 7.14% in 14 pleural and ascites samples.The mutation types included G12C,G12D,G12A,G12V,G13D and Q61H,the mutation rate had no statistical difference among 3 kinds of samples (P=0.064 8);the mutation rate was 6.96% in male patients and 8.59% in female patients,the difference was not statistically significant(P=0.574 0);the mutation rates were 4.76% in the patients aged 30-<45 years old,5.34% in the patients aged 45-<60 years old and 9.22% in the patients aged ≥60 years old,the differences were not statistically significant (P=0.250 3).ConclusionThe mutation types of K-ras gene are mainly G12C,G12D,G12V and G13D.The mutation rate of K-ras gene has no significant differences among different types of sample,different genders and different ages.

Key words:lung cancer;K-ras;gene mutation status

(收稿日期：2015-09-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.013

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)03-0321-03

作者簡介：盧麗琴，女，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤治療方面的研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:13391071510@163.com。