胡冬群， 杜 江， 李 楊， 陳德媛， 危 英*

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系， 貴州 貴陽 550002； 2.貴州省藥品檢驗所， 貴州 貴陽 550004)

貴州鈍藥野木瓜藥材的質(zhì)量測定

胡冬群1， 杜 江1， 李 楊2， 陳德媛1， 危 英1*

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系， 貴州 貴陽 550002； 2.貴州省藥品檢驗所， 貴州 貴陽 550004)

為了解鈍藥野木瓜藥材的質(zhì)量，并為中藥鈍藥野木瓜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考和為藥材的生產(chǎn)、流通、使用及檢驗提供依據(jù)，按照2010版《中國藥典》附錄藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法，對貴州鈍藥野木瓜進行了常規(guī)檢測、性狀、顯微鑒別，采用薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC),測定其指標(biāo)性成分荷苞花苷B的含量。結(jié)果表明：貴州不同地區(qū)的10批次鈍藥野木瓜藥材的水分含量不超過11%，總灰分不高于7.0%，酸不溶性灰分不高于0.6%，醇溶性浸出物不低于17%；性狀與顯微特征一致性好；藥材甲醇提取液TLC斑點清晰，分離度好；荷苞花苷B含量在0.083 2～0.832 μg，線性關(guān)系良好(r2=0.999 6),平均加樣回收率為99.53%，RSD為2.04%(n=6)。

鈍藥野木瓜； 藥材質(zhì)量； 荷苞花苷B； HPLC

鈍藥野木瓜(StauntonialeucanthaDiels ex Y. C. Wu)系木通科(Lardizabalacea)野木瓜屬常綠木質(zhì)藤本植物，又稱繞繞藤、五葉木通(浙江)、九月黃(安徽)，生于海拔300～920 m的山地疏林或密林中、山谷溪邊和丘陵林緣，主要分布在貴州、四川、安徽、江浙和兩廣一帶[1]。性甘、溫。氣微，味淡，微苦、澀。歸肝、腎、脾經(jīng)。具有袪風(fēng)活絡(luò)，利水消腫的功效。在民間主要用于風(fēng)濕痹痛，小便不利，水腫等病癥的治療。2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》已將鈍藥野木瓜(S.leucanthaDiels ex Y. C. Wu.)、短藥野木瓜(S.brachybotryaT. Chen.)和五指那藤[S.obovatifoliolaHayata subsp. intermedia(Y.C.Wu)T. Chen.]收載入藥[2]，但僅有性狀鑒別，無顯微鑒別和相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[3-4]。由于同屬植物之間的親緣性及化學(xué)成分的相似性，根據(jù)2010版《中國藥典》收載的野木瓜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，參照2010版《中國藥典》附錄方法，對鈍藥野木瓜藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分及醇性浸出物進行檢測，并對藥材進行性狀和生藥學(xué)研究，以荷苞花苷B為指標(biāo)性成分，對鈍藥野木瓜藥材中荷苞花苷B進行定性和定量研究，為提升民族藥藥材質(zhì)量，推進民族藥現(xiàn)代化進程，豐富和發(fā)展貴州民族藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 鈍藥野木瓜藥材分別于2009-2015年采自貴州省都勻、丹寨、黎平、綏陽、貴定、三都、從江、榕江等8地，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院鑒定為鈍藥野木瓜(S.leucanthaDiels ex Y. C. Wu.)，貯存在貴陽中醫(yī)學(xué)院植物化學(xué)教研室。荷苞花苷B購置于中國藥品生物制品檢定所(批號：X9AV-3CAM，純度>96.0%)。水合氯醛、甘油(蘇州弘泰化工有限公司)，聚酰胺(河北恒奧化工有限公司)，三氯化鐵(成都錦泰化工有限公司)、甲醇、磷酸(分析純重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司)、乙腈(色譜純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2 儀器 滑走切片機(美國A.D)、顯微鏡(Olympus B×51，日本Olympus公司)、成像系統(tǒng)(Olympus DP 72，日本Olympus公司)、薄層色譜點樣儀(CAMAGLinomat，瑞士卡瑪公司)、島津雙波長飛點薄層掃描儀(CS-9301 PC，上海富眾生物科技發(fā)展有限公司)、馬弗爐(SX2-4-10上海嘉展儀器設(shè)備有限公司)、恒溫水浴鍋(HH-S2北京科學(xué)儀器有限公司)、硅膠G預(yù)制板100 mm×200 mm(青島海洋化工廠分廠)、美國Agilent 110型高效液相色譜儀(VWD紫外檢測器、四元泵、自動進樣器美國Agilent)、海洋柱(C18250 mm×4.6 mm×5 μm)(杭州技馳科技有限公司)。

1.2 生物學(xué)鑒別

1.2.1 性狀鑒別 通過觀察鈍藥野木瓜植株實物，結(jié)合相關(guān)的文獻資料[2]，對藥材性狀進行系統(tǒng)觀察和描述，確定性狀鑒別的主要特征。

1.2.2 顯微組織鑒別 取鮮品藥材藤莖直接用滑走切片機切片；另取干鈍藥野木瓜葉預(yù)處理后，用刀片在表面輕輕劃一刀，用鑷子從刀痕處撕取表皮，撕得的表皮置于載玻片中央，加水合氯醛透化并蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。

1.2.3 粉末特征 取適量干燥藥材藤莖和葉，研粉，用水合氯醛試劑透化后稀甘油裝片。用顯微鏡觀察并照相。

1.3 薄層色譜鑒別

1.3.1 對照品溶液的制備 取標(biāo)準(zhǔn)品荷苞花苷B對照品，加甲醇制成1 mg/mL溶液，作為對照品溶液。

1.3.2 對照藥材溶液的制備 分別取采自貴州各地的藥材根莖(葉)粉末5 g，加甲醇50 mL，加熱回流1 h過濾，濾液蒸至約1 mL，置于已處理好的聚酰胺柱(30～60目，5 g，內(nèi)徑為1.5 cm，用水濕法裝柱)上，用10%乙醇80 mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用稀乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

1.3.3 薄層色譜條件及其結(jié)果 吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(100∶17∶13∶0.5)為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。

1.4 水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物的測定

水分測定參照《中國藥典》2010年版一部附錄IXH水分測定法(烘干法)，總灰分、酸不溶性灰分測定法參照《中國藥典》2010年版一部附錄IX K灰分測定法，浸出物測定參照《中國藥典》2010年版一部附錄XA浸出物測定法，采用熱浸法測定醇溶性浸出物。

1.5 荷苞花苷B含量測定

1.5.1 色譜條件 色譜柱為Ocean C18(25 mm×4.6 mm，5 μm)柱，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(17∶83),流速1 mL/min，柱溫30oC，紫外檢測波長324 nm，進樣量10 μL。

1.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品4.16 mg,置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度搖勻，制成含荷苞花苷B 0.416 mg/mL對照品溶液，備用。

1.5.3 供試品溶液的制備 參照文獻[5]取鈍藥野木瓜粉末(過3號篩)1.0 g置于150 mL具塞錐形瓶中，用移液管精密加甲醇25 mL，并稱重。在水浴鍋上加熱回流1 h，待冷卻后補重稱量，搖勻后過濾，濾液經(jīng)(0.45 μm)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精密吸取上述對照品溶液1 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度搖勻，制成含荷苞花苷B 0.083 2 mg/mL溶液，分別吸取1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL進樣，按色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品進樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。

1.5.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批次(貴州都勻)鈍藥野木瓜老莖粉末6份，每份約1.0 g，按方法1.5.3制備供試品溶液，各取10 μL進樣，記錄峰面積。

1.5.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批次(貴州都勻)鈍藥野木瓜老莖粉末約1.0 g，按方法1.5.3制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0 h,2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h各進樣10 μL，記錄峰面積。

1.5.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批次(貴州都勻)鈍藥野木瓜老莖粉末約0.5 g，各加入對照品適量，按方法1.5.3制備，配制樣品溶液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，分別吸取10 μL進樣分析，測定荷苞花苷B的含量，計算加樣回收率。

1.5.9 樣品含量的測定 按上述建立好的方法對貴州省8個地區(qū)的10批鈍藥野木瓜中的荷苞花苷B進行測定，每個批次樣品作3個平行樣，取樣品溶液10 μL進樣分析，測定峰面積，取平均值，計算荷苞花苷B的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈍藥野木瓜的性狀特征

全株木質(zhì)藤本，藤莖呈長圓柱形，微彎曲，長20～80 cm，直徑0.2～2 cm，細(xì)莖表面棕色或灰棕色，有光澤，具細(xì)縱紋，可見小枝痕或葉痕；老莖表面棕褐色，具粗縱紋，外皮脫落處呈棕紅色。質(zhì)硬，不易折斷。切斷面皮部窄，深棕色，木部寬廣，淡黃白色，有細(xì)密的放射狀紋理和成行小孔，髓部小。掌狀復(fù)葉互生，小葉5～7片，小葉倒卵狀長圓形，長3.5～11 cm，寬1.5～5 cm，薄革質(zhì)，頂端急尖或短漸尖，基部闊楔形，邊緣全緣微背卷，上表面棕綠色，有光澤，下表面灰黃綠色，主脈顯，小葉柄長0.5～3 cm。氣微，味微，澀苦。

2.2 鈍藥野木瓜莖的橫切面特征

從圖1看出，老莖木栓層較厚，約由10余列木栓細(xì)胞組成，內(nèi)側(cè)有1～2層石細(xì)胞散在或形成環(huán)形。皮層有6～7層類多邊形的薄壁細(xì)胞組成，細(xì)胞中含淀粉粒及草酸鈣棱晶。中柱寬廣，維管束外韌型。中柱鞘纖維束成新月形并與射線喇叭口處的石細(xì)胞群連成環(huán)。韌皮部明顯，形成層可見。木質(zhì)部寬廣，細(xì)胞壁木化，導(dǎo)管類圓形，大小不等。隨射線由數(shù)列長橢圓形細(xì)胞組成，細(xì)胞壁孔明顯。髓部細(xì)胞類圓形，壁厚，木化，有的具紋孔。

2.3 鈍藥野木瓜葉的表面特征

從圖2、圖3可見，上表皮細(xì)胞類多邊形，垂周壁微波狀彎曲，氣孔分布不均勻，較小，不定式。下表皮細(xì)胞垂周壁成波狀鑲嵌排列，可見乳突及少數(shù)氣孔。2.4 鈍藥野木瓜的粉末特征

從圖3看出，本品粉末中草酸鈣棱晶較多，且大小不一。孔紋導(dǎo)管碎片多見，直徑約30～80 μm，螺紋導(dǎo)管較細(xì)小。葉碎片，可見細(xì)胞壁成波狀彎曲的表皮細(xì)胞。

2.5 鈍藥野木瓜的薄層色譜

從圖4看出，供試品與對照品在薄層色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點，說明10批貴州不同地區(qū)的鈍藥野木瓜藥材中均含有荷苞花苷B成分。

2.6 鈍藥野木瓜的水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物含量

測定結(jié)果表明(表1)，不同產(chǎn)地的鈍藥野木瓜藥材水分含量在10.51%～11.23%，平均10.745%；總灰分含量為5.56%～7.95%，平均6.477%；酸不溶性灰分含量0.61%～0.79%，平均0.691%；醇溶性浸出物含量為16.12%～18.38%，平均值為17.557%。不同產(chǎn)地的相應(yīng)含量存在一定的差異。

圖1 鈍藥野木瓜的老莖橫切面(×100)

Fig.1 Detailed transverse section diagram of older stem tissue ofS.leucantha(×100)

圖2 鈍藥野木瓜葉的上表皮 (×100)(左)和下表皮特征(×400)(右)

注：1石細(xì)胞,2草酸鈣棱晶, 3纖維,4葉表皮碎片,5孔紋導(dǎo)管。

注：1～10鈍藥野木瓜藥材依次來源于都勻、都勻、丹寨、丹寨、黎平、綏陽、貴定、三都、從江和榕江,S為對照品。

Note：1～10, S. leucantha Diels ex Y. C. Wu(Duyun, Duyun, Danzhai, Danzhai, Liping, Suiyang, Guiding,Sandu,Congjiang and Rongjiang)；S, reference substance.

圖4 鈍藥野木瓜荷苞花苷B薄層色譜

Fig.4 Thin layer chromatograms of calceolarioside B inS.leucantha

表1 不同產(chǎn)地鈍藥野木瓜水分、總灰分、酸不溶性灰分 及浸出物含量(n= 3)

Table 1 Contents of moisture, total ash, acid-insoluble ash and extracts ofS.leucanthafrom different producing areas

批次Batch來源Source水分/%Moisture總灰分/%Totalash酸不溶性灰分/%Acid?insolubleash醇溶性浸出物/%Extracts1都勻10．666．030．7617．872都勻10．635．980．6718．143黎平11．237．950．7916．124貴定10．656．040．6416．845丹寨10．757．290．7517．416丹寨10．797．430．7317．497三都10．646．000．6317．718綏陽10．786．480．6818．069從江10．815．560．6117．5510榕江10．516．010．6518．38

2.7 荷苞花苷B的含量

2.7.1 荷苞花苷B含量測定方法的可行性 方法的試驗結(jié)果表明(圖5)，荷苞花苷B進樣量在0.083 2～0.832 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。相應(yīng)的回歸方程為y=115.01x+22.73,r2=0.999 6。精密度試驗的荷苞花苷B峰面積RSD為0.33%，表明方法精密度良好；重復(fù)性試驗的荷包花苷B峰面積RSD為2.67%，表明；鈍藥野木瓜藥材重現(xiàn)性良好；穩(wěn)定性試驗藥材中荷苞花苷B的RSD為2.8%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定；加樣回收率試驗的荷苞花苷B的加樣平均回收率為100.24%，RSD為2.23%(表2)，表明試驗方法科學(xué)、合理。

圖5 對照品(A)及樣品(B)的HPLC色譜

Fig.5 HPLC chromatograms of reference substance (A)andS.leucantha(B)

表2 荷苞花苷B加樣回收率(n= 6)

注：平均回收率為100.24%，RSD為2.23%。

Note：The average recovery rate was 100.24%,RSDis 2.23%.

2.7.2 樣品含量的測定 由表3可知，同地區(qū)鈍藥野木瓜全株植物中荷苞花苷B的含量是老莖部位的1倍，這可能是莖木質(zhì)化而導(dǎo)致荷苞花苷B含量降低；也可能是葉的嫩莖部分含有較多的荷苞花苷B。由于野木瓜嫩枝主要從老莖處萌發(fā)，從保護藥用資源角度，建議多采收葉與嫩枝入藥。不同產(chǎn)地鈍藥野木瓜藥材中均能檢出荷苞花苷B，其含量以黔東南相對較高，在20.93～39.39 μg/g，平均25.84 μg/g，黔南在11.5～23.96 μg/g，平均17.48 μg/g；鈍藥野木瓜中荷苞花苷B的含量以榕江最高，達39.39 μg/g，是貴定的3倍以上。

表3 鈍藥野木瓜中荷苞花苷B的含量(n= 3)

3 結(jié)論與討論

1) 建立常規(guī)檢測指標(biāo)，目的是為了有效控制藥材中泥沙和灰塵等雜質(zhì)的量。檢測結(jié)果顯示，鈍藥野木瓜藥材水分含量均值為10.73%，總灰分含量均值為7.28%，酸不溶性灰分含量均值為0.69%，醇溶性浸出物含量均值為17.54%，與《中國藥典》中野木瓜(S.ChinensisDC)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定相比較，其差異在可控范圍，試驗結(jié)果合理，可供鈍藥野木瓜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考。TLC研究結(jié)果表明，10批鈍藥野木瓜藥材中均可檢出荷苞花苷B，且分離度好，斑點清晰，可供鈍藥野木瓜的定性檢測指標(biāo)參考。

2) 試驗參照2010版《藥典》同屬品種野木瓜(S.chinensisDC.)的含量檢測方法，經(jīng)HPLC測定荷苞花苷B的含量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.1%磷酸水(68∶32)溶液作為流動相，分離效果不好，而選用乙腈-0.1%磷酸水溶液溶劑系統(tǒng)洗脫，分離效果很好，能夠使供試品中目標(biāo)組分25 min內(nèi)出峰，且理論塔板數(shù)按荷苞花苷B計算不低于3 000，樣品中荷苞花苷B與相鄰峰分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

3) 由于植物生長環(huán)境因素不同，各地的存在一定的差異性。鈍藥野木瓜中荷苞花苷B的含量黔東南地區(qū)在20.93～39.39 μg/g，普遍高于黔南地區(qū)(11.5～23.96 μg/g)，黔產(chǎn)野木瓜屬植物五指那藤〔S.obovatifoliolaHayata subsp. intermedia(Y. C. Wu)T. Chen.〕和尾葉拉藤〔StauntoniaobovatifoliolaHayata subsp. urophylla(Hand.- Mazz) H. N. Qiu〕中均富含三萜類化合物，并且一些化合物顯示出抗HIV-1蛋白酶活性[6-7]。為系統(tǒng)研究民族藥鈍藥野木瓜化學(xué)成分與藥理作用，將進一步開展鈍藥野木瓜藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及譜效學(xué)研究。

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(責(zé)任編輯： 聶克艷)

Quality Determination ofStauntonialeucanthain Guizhou

HU Dongqun1， DU Jiang1， LI Yang2， CHEN Deyuan1, WEI Ying1*

(1.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550002； 2.DrugandFoodControlInstituteofGuizhouProvince,Guiyang,Guizhou550004,China)

To know the quality ofS.leucantha, and provide references for quality standard setting ofS.leucanthaand provide basis for production, circulation, application and examination ofS.leucantha. According to the methods recorded in 2010 edition of Chinese Pharmacopoeia appendix, routine examination, identification of property and microscopic characteristics ofS.leucanthawere conducted and TLC and HPLC were employed to determine the content of calceolarioside B. Results:The limit of moisture contet, total ashes content and acid-insoluble ash content were less than 11%, 7% and 0.6%, respectively. The amount of methanol extract was more than 17%. The morphological and histological characters ofS.leucanthafrom different batches were of good consistency. The spots of methanol extracton TLC were clear and well-separated. Calceolarioside B content was 0.083 2～0.832 μg with an average recovery rate of 99.53%,the linear correlation was good(r2= 0.999 6),RSD=2.04%(n=6).

Stauntonialeucantha； medicinal material quality； calceolarioside B； HPLC

2015-10-28； 2016-04-11修回

貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目“鈍藥野木瓜藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”[黔教合KY字(2012)043]

胡冬群(1988-)，女，在讀碩士，研究方向：中藥學(xué)。E-mail：532075310@qq.com

*通訊作者：危 英(1969-),教授，博士,從事中藥與民族藥化學(xué)及新藥研究。 E-mail: weiying1969@126.com

1001-3601(2016)04-0175-0123-04

S38

A