胡根海， 董 娜

(河南科技學(xué)院， 現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

Genbank中陸地棉表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)與基因組序列(GSS)的SNP特征

胡根海， 董 娜

(河南科技學(xué)院， 現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

陸地棉基因組精細(xì)定位需要更加豐富的分子標(biāo)記，為了闡明單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記資源開(kāi)發(fā)利用的前景，對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中陸地棉表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)和基因組序列(GSS)進(jìn)行分析。下載GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的陸地棉EST序列及GSS序列，利用DNAStar軟件進(jìn)行疊連群構(gòu)建及其候選SNP位點(diǎn)分析。結(jié)果表明：陸地棉EST序列307 414條及GSS序列242 015條，EST序列構(gòu)建3 737個(gè)疊連群，序列累計(jì)10 477 241 bp。由4條及以上序列組成的疊連群累計(jì)序列長(zhǎng)度為3 761 800 bp，發(fā)現(xiàn)候選SNP位點(diǎn)1 007 258個(gè)，疊連群平均出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)最低頻率為2.32%。GSS序列共構(gòu)建1 517個(gè)疊連群，序列累計(jì)1 625 700 bp，發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)574 296個(gè)，疊連群平均出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)最低頻率為9.18%。陸地棉的EST和GSS均有頻率較高SNP位點(diǎn)，GSS出現(xiàn)SNP頻率高于EST序列，開(kāi)發(fā)SNP引物3 254對(duì)。

陸地棉； 疊連群； SNP頻率； GenBank

我國(guó)現(xiàn)有的陸地棉品種來(lái)自47個(gè)基礎(chǔ)種質(zhì)，品種間親緣關(guān)系近，分子標(biāo)記多態(tài)性較低。據(jù)最新報(bào)道[1]，陸地棉高密度連鎖圖譜共整合2 292個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，覆蓋基因組5 115.16 cM，平均2.23 cM有1個(gè)標(biāo)記，該標(biāo)記數(shù)量和密度尚不能滿足陸地棉基因組精細(xì)定位的需要，高密度精細(xì)定位是進(jìn)一步解析基因功能的基礎(chǔ)，棉花重要農(nóng)藝性狀的基因組精細(xì)定位需要加大現(xiàn)有圖譜密度。新型分子標(biāo)記SNP(Single Nucleotide Polymorphism)的出現(xiàn)，為進(jìn)一步加密陸地棉圖譜提供可能。SNP是廣泛存在于植物基因組中的一類DNA高頻序列變異，是標(biāo)記密度最高的一種遺傳多樣性標(biāo)記，SNP比SSR(simple sequence repeats)標(biāo)記具有更高的穩(wěn)定性[2]，在群體中符合孟德?tīng)栠z傳定律，可用于遺傳關(guān)聯(lián)分析[3]，還可用于材料的基因分型[4-5]。SNP通常用DNA芯片自動(dòng)化檢測(cè)[6-7]，也可用簡(jiǎn)化的EcoTILLING 技術(shù)[8]和普通PCR方法實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[4,9]。目前，SNP已成為分子標(biāo)記輔助育種的一種新型工具。但諸多作物SNP開(kāi)發(fā)剛起步僅在荔枝[10]、花生[11]、菊花[12]、葡萄[13]、栽培番茄[3]和大白菜[14]等作物中進(jìn)行開(kāi)發(fā)。在陸地棉上利用數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)EST(expressed sequence tag)-SSR標(biāo)記已有報(bào)道[15]，但開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記尚未見(jiàn)報(bào)道。已有記載顯示陸地棉SNP具有良好分型效果[16]，筆者擬利用NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的陸地棉GSS(genomic survey sequence)和 EST序列數(shù)據(jù)，使用生物信息學(xué)軟件分析陸地棉SNP標(biāo)記的潛在存在數(shù)量，對(duì)陸地棉SNP進(jìn)行開(kāi)發(fā)，以期為陸地棉基因組精細(xì)定位提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)材料

陸地棉EST和GSS序列下載于NCBI(美國(guó)國(guó)家生物信息中心)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，下載序列以FASTA格式保存，下載時(shí)間為2015年5月5號(hào)。

1.2 序列拼接形成疊連群

下載序列解壓后，采用EST-trimmer和cross-match程序清理下載序列中的短序列和載體序列，屏蔽低復(fù)雜度序列，處理后序列用DNAStar軟件包的子程序SeqMan進(jìn)行疊連群分析。

1.3 SNP位點(diǎn)分析及引物開(kāi)發(fā)

使用SeqMan軟件找出候選SNP，SNP出現(xiàn)頻率=候選SNP的數(shù)目/疊連群長(zhǎng)度×100%；根據(jù)候選SNP位點(diǎn)序列，使用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)陸地棉SNP引物，基本檢索條件：疊連群長(zhǎng)度≥500 bp，組成序列條數(shù)≥10；篩選引物標(biāo)準(zhǔn)：長(zhǎng)度18～24 bp，GC含量40%～60%，退火溫度(Tm) 40～60℃，不產(chǎn)生引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物錯(cuò)配，引物中無(wú) 6個(gè)連續(xù)堿基出現(xiàn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為200～500 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉EST與GSS序列的疊連群構(gòu)成及SNP出現(xiàn)頻率

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中總計(jì)下載307 414條陸地棉EST序列，通過(guò)剔除短序列和載體，屏蔽低復(fù)雜度序列，獲得有用序列255 002條，疊連群構(gòu)建后，有9 002條序列未組裝成疊連群，序列組裝共使用246 000條序列，構(gòu)建3 737個(gè)疊連群。疊連群最長(zhǎng)達(dá)3 912 bp，其SNP候選位點(diǎn) 2 972個(gè)，出現(xiàn)SNP頻率75.97%，最短1個(gè)疊連群長(zhǎng)度僅 142 bp，無(wú)候選SNP位點(diǎn)存在。疊連群累計(jì)長(zhǎng)度3 761 800 bp，鑒定候選SNP位點(diǎn)1 007 258個(gè)，SNP位點(diǎn)出現(xiàn)的平均頻率為26.77%。從疊連群的長(zhǎng)度與數(shù)量組成看，較長(zhǎng)(≥2000 bp)53條，較短(≤499 bp)90條，疊連群長(zhǎng)度主要集中在500～1 500 bp，約占86.76%，其SNP出現(xiàn)頻率隨疊連群長(zhǎng)度增加也在增加，但陸地棉的SNP位點(diǎn)分布在EST中不均勻。

最長(zhǎng)疊連群長(zhǎng)度為10 498 bp，有7 345個(gè)SNP候選位點(diǎn)，疊連群SNP出現(xiàn)頻率69.97%；最短1個(gè)疊連群長(zhǎng)度僅220 bp，無(wú)候選SNP位點(diǎn)存在。由表1可知，不同長(zhǎng)度疊連群的數(shù)目表現(xiàn)很大差異，疊連群越長(zhǎng)其數(shù)目越少，統(tǒng)計(jì)疊連群累計(jì)長(zhǎng)度3 761 800 bp，鑒定出候選SNP位點(diǎn)574 296個(gè)，SNP平均出現(xiàn)頻率為44.57%。從疊連群的長(zhǎng)度與數(shù)量看，疊連群長(zhǎng)度主要集中在500～2 000 bp，約占91.67%，其SNP出現(xiàn)頻率隨疊連群長(zhǎng)度增加而增加，但分析陸地棉的SNP位點(diǎn)在GSS疊連群中分布并不均勻。

2.2 陸地棉 EST 與 GSS序列疊連群組成條數(shù)及SNP 出現(xiàn)頻率

對(duì)3 737條疊連群進(jìn)行構(gòu)成疊連群序列條數(shù)分析顯示，僅有2條序列構(gòu)成的疊連群高達(dá)1 801個(gè)，由3條序列構(gòu)成疊連群有752條，這些疊連群因組成序列低于4條，故未檢測(cè)到SNP。由表2可見(jiàn)，4～6條序列構(gòu)成的疊連群，SNP出現(xiàn)頻率為2.32%，隨著組成疊連群的序列條數(shù)增加疊連群中出現(xiàn)SNP的頻率也在增加，最高疊連群是2個(gè)由112條、119條序列構(gòu)成疊連群，其出現(xiàn)SNP頻率均值為46.36%。

表1 陸地棉EST與GSS序列的疊連群構(gòu)成與SNP出現(xiàn)頻率

Table 1 Contigs constitute and SNP frequency of EST and GSS sequences fromG.hirsutum

疊連群長(zhǎng)度/bpContigslength疊連群數(shù)/條NumberofcontigsSNP位點(diǎn)/個(gè)SNPsitesSNP出現(xiàn)頻率/%SNPfrequencyEST≥30003147872．382000～299950136668．301500～199935574349．631000～1499122932332．30500～999203613226．50≤499905624．34GSS≥100002739170．155000～99994387564．162000～499979169759．981000～199937134933．83500～99997328730．11200～49937339．18

表2 陸地棉 EST序列組成疊連群的序列條數(shù)及候選SNP 出現(xiàn)頻率

Table 2 Number of sequences of contigs and candidate SNP frequency of EST sequences fromG.hirsutum

疊連群組成序列數(shù)/條Sequencesofcontigs疊連群數(shù)/條NumberofcontigsSNP出現(xiàn)頻率/%SNPfrequencyEST≥100246．3650-991145．8640～491145．0630～391443．3920～294642．9610～1920942．91913641．9786012．677938．234～66842．32GSS≥1001374．1650～992670．8710～4917655．874～936422．49

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中總計(jì)下載242 015條陸地棉GSS序列，通過(guò)剔除短序列和載體，屏蔽低復(fù)雜度序列，最后獲得有用序列24 144條，其中11 393條序列未組裝成疊連群，序列組裝共使用11 234條序列，構(gòu)建1 517個(gè)疊連群。組成疊連群序列最多的有656條序列。由表2可知，在4條以上序列組成疊連群中，主要有4～49條序列組成，隨著組成疊連群的序列數(shù)目增加，其SNP位點(diǎn)數(shù)和SNP出現(xiàn)頻率也在增加。但在計(jì)算統(tǒng)計(jì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著組成疊連群序列的減少，出現(xiàn)SNP位點(diǎn)數(shù)極少或無(wú)位點(diǎn)的頻率也在增加。

2.3 陸地棉SNP 引物的開(kāi)發(fā)

疊連群組成序列≥10條的共有508個(gè)疊連群，依據(jù)SNP位點(diǎn)兩側(cè)序列和引物篩選的基本原則，保守設(shè)計(jì)即可得到3 254對(duì)引物，表明陸地棉的SNP可設(shè)計(jì)的引物數(shù)量非常多，該標(biāo)記在育種利用中有較大挖掘潛力。

3 結(jié)論與討論

單核苷酸多態(tài)性在植物基因組中廣泛存在，較高的多態(tài)性使材料的遺傳多樣性變得容易區(qū)分，也讓生產(chǎn)上種子純度鑒定變得簡(jiǎn)單[14]，SNP是單核苷酸變異，可能發(fā)生在基因的內(nèi)含子區(qū)、表達(dá)調(diào)控區(qū)和基因功能區(qū)，因此部分SNP位點(diǎn)可能和基因的功能直接相關(guān)。EST是測(cè)序獲得的短cDNA 序列，是完整基因的一部分。因此，基于EST的SNP更有可能與功能基因及農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)。

本研究中分析307 414條陸地棉EST序列，平均每43.1 bp EST序列中出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，SNP位點(diǎn)出現(xiàn)頻率約為2.32%，比菊花[12]EST的SNP平均出現(xiàn)頻率(0.15%)略高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)吳茱萸SOD基因分析得到的SNP 位點(diǎn)出現(xiàn)頻率(20%)[17]。這種結(jié)果的差異可能因?yàn)槟壳熬栈‥ST數(shù)據(jù)偏少，很多SNP位點(diǎn)未被發(fā)現(xiàn)；陸地棉EST發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)少于吳茱萸的SOD基因，可能因EST一般為短cDNA 序列，僅完整基因的一小部分，而吳茱萸SOD基因分析是完整基因。從陸地棉GSS數(shù)據(jù)中獲得574 296個(gè)候選SNP位點(diǎn)，SNP的出現(xiàn)頻率最低為9.18%，平均每10.89 bp出現(xiàn)1個(gè)候選SNP位點(diǎn)。已有結(jié)果顯示，在水稻基因組序列中，平均每89 bp出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)[18]；在花生栽培種基因組DNA的測(cè)序數(shù)據(jù)中，平均每27.86 bp出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)[11]；玉米基因組DNA中平均每61 bp序列有1個(gè)SNP[19]；試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示陸地棉GSS序列的SNP出現(xiàn)頻率高于水稻、花生和玉米，比較4個(gè)物種可見(jiàn)物種間差別較大，這可能是物種不同引起。比較陸地棉EST和GSS構(gòu)建的各個(gè)疊連群中含有的SNP數(shù)量，可見(jiàn)構(gòu)成疊連群的序列條數(shù)越多，出現(xiàn)的SNP位點(diǎn)數(shù)量也越多，與Duran C等[20]在大麥EST序列的研究結(jié)果基本一致。EST序列和GSS序列出現(xiàn)SNP的頻率不均勻，與前人在菊花[12]上研究結(jié)果一致。

比較由EST和GSS獲得結(jié)果可知，利用GSS序列檢測(cè)到其有更多的SNP位點(diǎn)和更高出現(xiàn)頻率，這可能是因?yàn)镚SS序列是基因組序列，含有非編碼區(qū)，這些區(qū)域的突變不會(huì)直接導(dǎo)致植物體變異，具有更低選擇壓和更高突變頻率。陸地棉基因組序列候選SNP出現(xiàn)頻率較高還可能與其為異源四倍體起源有關(guān)，這與唐月異[11]研究作物染色體倍數(shù)越大SNP頻率越高一致。本研究首次對(duì)陸地棉的GSS和EST序列進(jìn)行了SNP標(biāo)記出現(xiàn)頻率及可能數(shù)量進(jìn)行分析并開(kāi)發(fā)了3 254對(duì)SNP檢測(cè)引物， SNP變異比SSR豐富，是更有前景的新一代標(biāo)記。

[1] Yuzhen Shi,Wentan Li,Aiguo Li,et al.Constructing a high density linkage map for Gossypium hirsutum×Gossypium barbadense and identifying QTLs for lint percentage[J].Journal of Integrative Plant Biology,2015,57(5):450-467.

[2] 李 雪,田紅麗,王鳳格,等.SSR和SNP兩種標(biāo)記技術(shù)在玉米品種真實(shí)性鑒定中的比較分析[J].分子植物育種,2014,12(5):1000-1004.

[3] 郝轉(zhuǎn)芳,蘇治軍,李 亮,等.基于SNP標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析在玉米耐旱研究中的應(yīng)用[J].作物雜志,2009(6):1-7.

[4] 李亞玲,李景富,康立功,等.番茄Mi-1基因的SNP分型[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(10):36-42.

[5] 姚遠(yuǎn)颋,謝青軒,杜培粉,等.利用SNP分型技術(shù)鑒別油菜FLC1與FLC3基因的AC組基因型[J].分子植物育種,2009,7(2):330-334.

[6] Olivier M.SNP genotyping using invader technology[J].Mutation Res,2005,573(1/2):103-110.

[7] 曹廷杰,謝菁忠,吳秋紅,等.河南省近年審定小麥品種基于系譜和SNP標(biāo)記的遺傳多樣性分析[J].作物學(xué)報(bào),2015,41(2)：197-206.

[8] 滕 斌,李澤福,羅志祥,等.利用EcoTILLING簡(jiǎn)化技術(shù)進(jìn)行水稻基因型鑒定及單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,20(3):254-260.

[9] Michaels S D,Amasino R M.A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR[J].Plant J.,1998,14(3):381-385.

[10] 孫清明,李永忠,向 旭,等.利用SNP和EST-SSR分子標(biāo)記鑒定荔枝新種質(zhì)御金球[J].分子植物育種,2013,11(3):403-414.

[11] 唐月異,張建成,王秀貞,等.GenBank中花生栽培種基因組DNA及EST序列的SNP分析[J].花生學(xué)報(bào),2010,39(2)：21-23.

[12] 萬(wàn)志兵,王言言,陳 黎.菊花EST-SNP的發(fā)掘與特征分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,41(5):84-86,90.

[13] 李 猛,郭大龍,劉崇懷,等.葡萄EST-SNP位點(diǎn)的信息與特征[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2012,38(3):263-270.

[14] 趙 新,王 永,蘭青闊,等.基于復(fù)合EST-SSR標(biāo)記的大白菜種子純度鑒定及SNP位點(diǎn)獲取[J].中國(guó)蔬菜,2013(14):31-38.

[15] 李華盛,范術(shù)麗,沈法富.從棉花ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的初步研究[J].棉花學(xué)報(bào),2005,17(4):211-216.

[16] 鄭煒佳,曲延英,謝元元,等.ARMS-PCR對(duì)棉花SNP分型的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,50(12):2182-2188.

[17] 吳 波,高 丹,潘超美,等.吳茱萸SOD基因片段克隆和SNP分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(6):1206-1211.

[18] Nasu S,Suzuki J, Ohta R,et a1.Search for and analysis of single nucleotide polymorphisms(SNPs) in rice(Oryza sativa，Oryza rufipogon)and establishment of SNP markers[J].DNA Res.,2002,9:163-171.

[19] Ching A,Caldwell K S,Jung M,et a1.SNP frequency，haplotype structure and linkage disequilibrium in elite maize inbred lines[J].BMC Genet,2002,3:19．[20] Duran C,Appleby N,Vardy M,et a1.Single nucleotide polymorphism discovery in badey using auto SNPdb[J].Plant Biotechnology Journal,2009,7:326-333.

(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

SNP Discovery in GSS and ESTs ofGossypiumhirsutumfrom GenBank

HU Genhai, DONG Na

(HenanCollaborativeInnovationCenterofModernBiologicalBreeding,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang,Henan453003,China)

In order to explore the SNP marker resources development prospects, which can provide abundant number of molecular markers for cotton genome fine positioning. 242 015 GSS sequences and 307 414 ESTs ofG.hirsutumdownloaded from GenBank in NCB1 were analyzed. 3 737 contigs were assembled from the EST sequences by DNAStar, and the length of the total contigs was 1 047 7241 bp. The length of the tota1 contigs with≥4 ESTs was 3 761 800 bp, from which 1 007 258 candidate SNPs were identified directly, and the average frequency of SNPs was 2.32%. 1 517 contigs were assembled from the GSS, and the length of the total contigs was 1 625 700 bp. From which 574 296 candidate SNPs were identified directly, and the average frequency of SNPs was 9.18%. Conclusion: The upland cotton EST and GSS all had higher frequency of SNP loci, SNP frequency of GSS was higher than that of ESTs, it was more valuable that SNP loci of GSS was utilized. 3 254 pairs of SNP primers were designed by Primer Premier 5.0 following the basic criteria.

Gossypiumhirsutum; contigs; SNP frequency; GenBank

2015-08-28； 2016-03-24修回

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“棉花早熟不早衰基因型的根系形態(tài)和生理機(jī)制研究”(31271648)；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目“轉(zhuǎn)基因耐鹽堿陸地棉新材料創(chuàng)制”(142102110126)

胡根海(1966-)，男，副教授，博士，從事棉花分子育種研究。E-mail: hgh1013@126.com

1001-3601(2016)04-0150-0021-03

S562； Q946.2

A