伍善東， 雷 平， 郭照輝， 單世平， 付祖姣， 程 偉

(湖南省微生物研究院， 湖南 長(zhǎng)沙 410009)

1株高效解鉀菌的分離、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

伍善東， 雷 平， 郭照輝， 單世平*， 付祖姣， 程 偉

(湖南省微生物研究院， 湖南 長(zhǎng)沙 410009)

為獲得高效的解鉀菌株，從長(zhǎng)沙縣油菜田土壤中分離有較強(qiáng)解鉀能力的菌株，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化特性及16SrDNA序列分析鑒定菌株，通過(guò)單因子試驗(yàn)與正交試驗(yàn)對(duì)解鉀能力最強(qiáng)的菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：解鉀能力最強(qiáng)菌株JK-3為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其發(fā)酵上清液中有效鉀含量較對(duì)照增加13.7 mg/L。最優(yōu)培養(yǎng)基為4.0%葡萄糖、0.1%蛋白胨、1.0%魚粉、0.5%MgSO4·7H2O；最優(yōu)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時(shí)間36 h、初始pH 7.2、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量2.0%，500 mL三角瓶裝液量為40 mL。

解鉀菌； 分離； 枯草芽孢桿菌； 微生物肥料

鉀是作物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)要素之一。據(jù)土壤普查資料顯示[1]，我國(guó)耕地缺鉀和嚴(yán)重缺鉀的比例分別約為70%和45%，肥料中的氮、磷、鉀比例為1∶0.4∶0.16，遠(yuǎn)小于發(fā)達(dá)國(guó)家的 1∶0.5∶0.4，已成為限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)提高的重要因素。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常施用化學(xué)鉀肥提供給作物生長(zhǎng)所需的鉀元素，但易破壞土壤結(jié)構(gòu)、有機(jī)質(zhì)含量下降[2]，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。土壤中95%的鉀為礦物鉀形態(tài)，存在于鉀長(zhǎng)石和云母這二大礦物中[3]，不能直接被植物吸收利用。解鉀細(xì)菌多是硅酸鹽細(xì)菌，其能分解礦物并釋放鉀等元素供植物利用，將土壤中無(wú)效鉀元素轉(zhuǎn)化為有效態(tài)鉀，同時(shí)也有固氮和解磷功能[4]。利用微生物從鉀長(zhǎng)石中獲得可供作物利用的有效鉀，有能耗低、成本少、無(wú)污染和方法簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是最有前途的鉀長(zhǎng)石提鉀方法[5]。盛下放等[6]分離到有高效解鉀活性的硅酸鹽細(xì)菌NBT，經(jīng)搖瓶振蕩培養(yǎng)120 h，菌株NBT的釋鉀量較對(duì)照增加226.0%。這些研究表明，解鉀菌釋鉀的相對(duì)量較多，但絕對(duì)量較小，有必要篩選更具解鉀效率的菌株。因此，筆者從油菜田中分離高效解鉀菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定并且優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，以期為微生物肥料的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，pH 7.2，去離子水1000.0 mL。亞歷山鮑羅夫培養(yǎng)基[7]：蔗糖5.0 g，Na2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eCl35.0 mg，CaCO30.1 g，鉀長(zhǎng)石粉1.0 g(去離子水5次清洗)，瓊脂20.0 g，pH 7.0，去離子水1 000.0 mL。液體培養(yǎng)基不加瓊脂?；A(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO31.0 g，(NH4)2SO41.0 g，NaCl 0.1 g，酵母膏0.5 g，K2HPO42.0 g，pH 7.4，去離子水1 000.0 mL。

1.2 解鉀菌的分離

采用5點(diǎn)取樣法，從長(zhǎng)沙縣油菜田采集土壤。稱取10 g土壤樣品加入到90 mL無(wú)菌水中，充分混勻，靜置5 min，按梯度稀釋至10-7，分別從10-5、10-6、10-73個(gè)稀釋梯度中各吸取0.2 mL菌液加入亞歷山鮑羅夫培養(yǎng)基平皿中，涂抹均勻，每個(gè)稀釋梯度3次重復(fù)，平皿倒至于30℃恒溫箱中培養(yǎng)4～5 d，挑取生長(zhǎng)勢(shì)好的菌落，劃線純化，3次重復(fù)，直至獲得純培養(yǎng)，保藏于4℃冰箱中。

1.3 菌株解鉀能力的測(cè)定

將待測(cè)菌株挑取一環(huán)接種于50 mL亞歷山鮑羅夫液體培養(yǎng)基中，以不接種的作為空白對(duì)照，30℃，180 r/min搖床培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)液經(jīng)4℃，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，利用火焰分光光度計(jì)測(cè)其鉀含量[8]。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 解鉀菌株的形態(tài)特征、生理生化鑒定 將菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基上，置于30℃的恒溫箱中培養(yǎng)2 d，觀察菌落特征，用接種環(huán)挑取純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。生理生化試驗(yàn)依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.4.2 解鉀菌株的16SrDNA序列分析 提取DNA后，對(duì)16S rDNA目的片斷進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]。引物序列：F， 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：去離子水39 μL，PCR buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)。72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物由上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，選擇同源性高的序列使用MEGA5.2軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 培養(yǎng)基成分的篩選試驗(yàn)

1.5.1 種子液的制備 將活化后的菌株接種于NA液體培養(yǎng)基，在30℃、180 r/min的條件下，搖床培養(yǎng)20 h。

1.5.2 培養(yǎng)基成分的篩選 通過(guò)單因子試驗(yàn)篩選適合菌株的最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，再用正交試驗(yàn)法確定培養(yǎng)基各組分的最佳含量。

1) 碳源。分別以含量為20 g/L的淀粉、麥芽糖、木糖、葡萄糖、甘露醇和蔗糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源，500 mL三角瓶中裝液量為100 mL，每個(gè)搖瓶中接入5 mL種子液，于30℃，180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h。按平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)。

2) 氮源。分別以含量為20 g/L的黃豆粉、牛肉膏、魚粉、蛋白胨、尿素、NH4NO3替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，方法同上。

3) 無(wú)機(jī)鹽。分別添加1 g/L的K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、ZnSO4、NaCL、CaCO3，替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽，方法同上。

1.5.3 正交試驗(yàn) 以優(yōu)化的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定各組分的最佳含量，方法同上。

1.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)

以優(yōu)化的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽配制培養(yǎng)基，進(jìn)行最適培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量試驗(yàn)[11-12]。培養(yǎng)溫度設(shè)置為20℃、24℃、28℃、32℃、36℃、40℃，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h和54 h，初始pH設(shè)置為6.0、6.4、6.8、7.2、7.6和8.0，轉(zhuǎn)速設(shè)置為90 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min和210 r/min，接種量設(shè)置為l.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%和6.0%，500 mL三角瓶裝液量設(shè)置為40 mL、60 mL、80 mL、100 mL、120 mL和140 mL，方法同上。

1.7 試驗(yàn)驗(yàn)證

培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，進(jìn)行50 L罐發(fā)酵驗(yàn)證，測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

從亞歷山鮑羅夫培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中初步分離到21株細(xì)菌，從中挑取生長(zhǎng)勢(shì)好的菌株6株，劃線純化后分別命名為JK-1、JK-2、JK-3、JK-4、JK-5和JK-6，保藏于4℃冰箱中。

2.2 菌株的解鉀效果

6株菌經(jīng)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)與對(duì)照上清液中有效鉀的含量分別為3.6～14.5 mg/L和0.8 mg/L，上清液中有效鉀的增加量為2.6～13.7 mg/L。其中，以JK-3發(fā)酵上清液中有效鉀的增加量最大，為13.7 mg/L。故選擇JK-3菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌落與形態(tài)特征 JK-3菌落在NA培養(yǎng)基上呈橢圓形或圓形，白色，表面干燥，邊緣不整齊。油鏡下觀察，菌體呈桿狀，圓端，有芽孢，卵圓形。(0.8～1.6)μm ×(1.9～5.5)μm，革蘭氏染色陽(yáng)性。

2.3.2 生理生化特征 JK-3能利用葡萄糖、蔗糖、木糖發(fā)酵產(chǎn)酸，甲基紅、V. P.試驗(yàn)陽(yáng)性，不能產(chǎn)生吲哚和卵黃卵磷脂酶，能使明膠液化，水解淀粉，產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶、氧化酶、硫化氫，利用檸檬酸鹽。初步確定JK-3為芽孢桿菌屬。

2.3.3 16S rDNA序列 菌株JK-3與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)親緣關(guān)系最近(圖示)，結(jié)合JK-3菌株的菌落形態(tài)特征和生理生化特征，確定該菌株為枯草芽孢桿菌。

圖示 16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的JK-3 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig. The phylogenetic tree of JK-3 strain based on 16S rDNA sequence

2.4 最佳培養(yǎng)基成分的確定

2.4.1 最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的篩選 由表1可知，當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，其發(fā)酵液中的菌液濃度達(dá)最大值，為6.2×108CFU/mL；以淀粉為碳源時(shí)，其發(fā)酵液中的菌液濃度最小，僅0.9×108CFU/mL。故最佳碳源為葡萄糖。在最佳氮源的篩選試驗(yàn)中，以蛋白胨為唯一氮源時(shí)，其發(fā)酵液中的菌液濃度最大，為8.9×108CFU/mL；其余依次為牛肉膏、魚粉、黃豆粉、尿素和NH4NO3，考慮成本因素，選擇蛋白胨和魚粉為氮源。在最佳無(wú)機(jī)鹽的篩選試驗(yàn)中，當(dāng)培養(yǎng)基中添加MgSO4·7H2O時(shí)，其發(fā)酵液中的菌液濃度最大，為6.4×108CFU/mL，故最佳無(wú)機(jī)鹽為MgSO4·7H2O。

表1 培養(yǎng)基中加入不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽后發(fā)酵液中的活菌數(shù)

2.4.2 碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的最佳添加量 由表2可見(jiàn)，通過(guò)正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)均值和極差分析，影響菌株JK-3發(fā)酵液中的菌液濃度的因素依次為B蛋白胨>A葡萄糖>D MgSO4·7H2O>C魚粉。經(jīng)方差分析，A葡萄糖(F=973.25>F0.01=6.23)、B蛋白胨(F=1226.00>F0.01=6.23)、C魚粉(F=140.25>F0.01=6.23)和D MgSO4·7H2O(F=369.25>F0.01=6.23)對(duì)菌株JK-3發(fā)酵液中菌液濃度影響均達(dá)極顯著水平，區(qū)組間差異不顯著(F=0.25

表2 菌株發(fā)酵的正交試驗(yàn)各因素水平均值及極差

2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)

從表3可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株JK-3發(fā)酵菌液濃度逐漸變大，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時(shí)，菌液濃度達(dá)最大值，為14.1×108CFU/mL，隨后培養(yǎng)溫度的升高菌液濃度逐漸變小。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，其菌液濃度呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)36 h時(shí)，其菌液濃度最高，達(dá)12.5×108CFU/mL。當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH在6.0～8.0時(shí)，發(fā)酵液中菌液濃度的變化較小，當(dāng)初始pH為6.0時(shí)，其菌液濃度最小，為9.1×108CFU/mL，初始pH為7.2時(shí)，其菌液濃度最大，為13.4×108CFU/mL。隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌液濃度呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，菌液濃度達(dá)最大，為12.2×108CFU/mL。當(dāng)接種量為2%時(shí)，菌液濃度達(dá)最大值，為13.7×108CFU/mL，但接種量再增大，菌液濃度反而變小，說(shuō)明接種量過(guò)大造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗增大，不利于菌體生長(zhǎng)。當(dāng)裝液量為40 mL時(shí)，發(fā)酵液菌液濃度最大，為14.3×108CFU/mL，隨著裝液量的增加，菌液濃度減小。綜合分析，最優(yōu)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間36 h，初始pH7.2，轉(zhuǎn)速180 r/min，接種量2%，裝液量40 mL。

表3 不同處理方式發(fā)酵液中的活菌數(shù)

2.6 50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)驗(yàn)證

依據(jù)培養(yǎng)基的最優(yōu)成分及其添加量和最優(yōu)培養(yǎng)條件，采用50 L罐進(jìn)行菌株JK-3的發(fā)酵，其發(fā)酵菌液濃度為2.4×109CFU/mL，說(shuō)明此培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件有利于菌株JK-3的發(fā)酵。

3 結(jié)論與討論

已報(bào)道的解鉀菌(硅酸鹽細(xì)菌)雖破壞鉀礦釋放可溶性鉀的能力顯著，但解鉀絕對(duì)量卻十分有限[13-14]。解鉀細(xì)菌從硅酸鹽礦物中濾取SiO2和K+的作用，是胞外多糖和有機(jī)酸等共同參與的結(jié)果[15]。鉀細(xì)菌浸取鉀礦釋放有效鉀仍存在解鉀效率低、解鉀速度慢等問(wèn)題，限制了其工業(yè)應(yīng)用[5]。因此，分離選育高效解鉀菌株很有必要。

本研究從土壤中分離到1株有較強(qiáng)解鉀能力的菌株JK-3，發(fā)酵上清液中有效鉀的含量比對(duì)照增加13.7 mg/L，結(jié)合其菌落形態(tài)和生理生化特性及16SrDNA序列分析，鑒定其為枯草芽孢桿菌。經(jīng)單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定發(fā)酵培養(yǎng)條件為4.0%葡萄糖、0.1%蛋白胨、1.0%魚粉、0.5%MgSO4·7H2O、培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時(shí)間36 h、初始pH 7.2、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量2.0%、裝液量40 mL。50 L罐發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵菌液濃度為2.4×109CFU/mL。下一步的工作將是JK-3菌肥的生產(chǎn)及大田試驗(yàn)。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Isolation and Identification of an Efficiency Potassium-releasing Bacterium Strain and Its Optimization of Culture Conditions

WU Shandong, LEI Ping, GUO Zhaohui, SHAN Shiping*, FU Zujiao, CHENG Wei

(HunanAcademyofMicrobiology,Changsha,Hunan410009,China)

An efficient potassium-releasing bacterium strain isolated from the soil of rape fields in Changsha County was identified by 16 S rDNA sequence analysis according to its colony morphological feature and physiological-biochemical characteristics and then the fermentation conditions were optimized by single-factor and orthogonal tests. Results: Jk-3 strain, an efficient potassium-releasing bacterium strain isBacillussubtilisand the available potassium content in the fermented supernatant fluid increases by 13.7% compared with CK. The optimal medium for JK-3 strain is 4.0% glucose, 0.1% peptone, 1.0% fish meal and 0.5% MgSO4· 7H2O, and the optimal culture conditions include 2.0% inoculum size, 40 mL liquid volume/500mL triangular bottle, initial pH 7.2, 180 r/min and 28℃ for 36 h.

potassium-releasing bacterium; isolation;Bacillussubtilis; microbial fertilizer

2015-09-01； 2016-04-10修回

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目“抗油菜菌核病微生物農(nóng)藥的研究與示范”(2015HK3056)；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“貪銅菌6-5富集土壤中重金屬鎘的分子機(jī)理研究”(13JJ2035)

伍善東(1978-)，男，工程師，從事植物保護(hù)與微生物肥料研究。E-mail:1059995305@qq.com

*通訊作者：?jiǎn)问榔?1978-)，男，副研究員，博士，從事農(nóng)田土壤重金屬污染防控、土壤肥料發(fā)酵工藝等研究。E-mail:ssp312@ hotmail.com

1001-3601(2016)05-0206-0077-04

Q938.1+3

A