胡小艷， 徐 蕾， 李博文

(1.萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，江蘇徐州 221004；2.上海海利生物技術(shù)股份有限公司，上海 201403)

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正交試驗(yàn)法優(yōu)化微波提取金絲桃苷工藝

胡小艷1， 徐 蕾1， 李博文2

(1.萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，江蘇徐州 221004；2.上海海利生物技術(shù)股份有限公司，上海 201403)

貫葉連翹(HypericumperforatumL.)屬于藤黃科金絲桃屬，貫葉連翹中含有多種具有生物活性的化學(xué)物質(zhì)，其中黃酮類化合物金絲桃苷(又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)就是其中之一。金絲桃苷具有多種藥理活性，唐敏等[1]研究證明金絲桃苷可通過清除機(jī)體自由基而發(fā)揮其抗氧化作用，從而起到對(duì)肝臟的保護(hù)作用；章家勝等[2]分析表明金絲桃苷可以抑制神經(jīng)細(xì)胞上的Ca2+而起到抑制疼痛的作用；陳紅艷等[3]研究指出金絲桃苷能明顯減輕大鼠的神經(jīng)病學(xué)癥狀，減小血面積，降低腦含水量，減輕腦水腫；Li等[4]報(bào)道金絲桃苷能抑制由t-BuOH誘導(dǎo)引起的DNA堿基氧化及細(xì)胞中氧化還原狀態(tài)變化，抑制促凋亡因子由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體。此外，有不少文獻(xiàn)報(bào)道金絲桃苷還具有抗炎[5]、抗血栓[6]、抗菌[7]、抗癌[8]、抗抑郁[9]以及增強(qiáng)免疫[10]的作用。

金絲桃苷的提取方法主要有乙醇熱回流提取、甲醇熱回流提取、乙醇超聲提取、甲醇超聲提取等方法，由于傳統(tǒng)方法所得產(chǎn)品純度和收率過低，成為金絲桃苷進(jìn)一步研究的瓶頸，微波可使貫葉連翹中的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁破裂，促使金絲桃苷從細(xì)胞內(nèi)釋放，進(jìn)而提高其提取率。該試驗(yàn)用微波技術(shù)提取貫葉連翹中的金絲桃苷，以金絲桃苷提取率為考察指標(biāo)，對(duì)影響該指標(biāo)的各因素進(jìn)行系統(tǒng)性研究，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，以期為提高金絲桃苷的提取率提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑貫葉連翹飲片，蘭州安泰堂中藥飲片有限公司提供；金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)，Sigma公司；乙腈和甲醇，色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；MAS-II型微波提取儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；FA2004型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Pine-tree純水機(jī)(北京湘順源科技有限公司)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1金絲桃苷提取。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g于250 mL燒杯中，乙醇浸泡放置2 h使其溶脹，在微波處理器中輻射，抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到金絲桃苷提取物。

1.3.2溶液中金絲桃苷的含量測(cè)定。

1.3.2.1色譜條件。Agilent HC-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為水乙∶腈∶磷酸緩沖液=50∶40∶10；檢測(cè)波長(zhǎng)365 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2.2供試液制備 。將微波提取所得金絲桃苷提取物用甲醇稀釋100倍，過0.45 μm有機(jī)濾膜，作為金絲桃苷供試液。

1.3.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。精密稱取10.00 mg金絲桃苷對(duì)照品，用10 mL甲醇溶解制成1 mg/mL金絲桃苷對(duì)照品甲醇溶液，用甲醇稀釋得到0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“1.3.2.1”色譜條件測(cè)定，所得平均峰面積分別為432 927、841 043、1 703 642、3 491 964、6 831 982。以金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，所得回歸方程為y=685 025x+5 838.9(R2=0.999 8)，表明金絲桃苷在濃度0.625～10.000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3金絲桃苷提取率的計(jì)算。金絲桃苷提取率=(提取液中金絲桃苷含量×提取液體積×稀釋倍數(shù))/貫葉連翹質(zhì)量×100%。

1.3.4單因素試驗(yàn)。

1.3.4.1輻射溫度對(duì)金絲桃苷提取率的影響。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g 于250 mL燒杯中，設(shè)定微波輻射時(shí)間9 min、微波功率500 W、料液比1：10，改變輻射溫度分別為20、30、40、50、60、70、80 ℃，測(cè)定提取液中金絲桃苷的含量，并計(jì)算提取率，考察輻射溫度對(duì)金絲桃苷提取率的影響。

1.3.4.2微波功率對(duì)金絲桃苷提取率的影響。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g于250 mL燒杯中，設(shè)定輻射溫度40 ℃、微波輻射時(shí)間9min、料液比1：10，改變微波功率分別為300、400、500、600、700、800 W，測(cè)定提取液中金絲桃苷的含量，并計(jì)算提取率，考察微波功率對(duì)金絲桃苷提取率的影響。

1.3.4.3微波輻射時(shí)間對(duì)金絲桃苷提取率的影響。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g于250 mL燒杯中，設(shè)定微輻射溫度40 ℃、微波功率500 W、料液比為1：10，微波輻射時(shí)間分別3、6、9、12、15 min，測(cè)定提取液中金絲桃苷的含量，并計(jì)算提取率，考察微波輻射時(shí)間對(duì)金絲桃苷提取率的影響。

1.3.4.4料液比對(duì)金絲桃苷提取率的影響。精密稱取貫葉連翹飲片10.00 g于250 mL燒杯中，設(shè)定輻射溫度40 ℃、微波功率500 W、微波輻射時(shí)間9 min，改變料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，測(cè)定提取液中金絲桃苷的含量，并計(jì)算提取率，考察料液比對(duì)金絲桃苷提取率的影響。

1.3.5正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以輻射溫度(A)、微波功率(B)、微波輻射時(shí)間(C)、液料比(D)為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)試驗(yàn)水平，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表(表1)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并進(jìn)行方差分析，以獲得金絲桃苷提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1　正交試驗(yàn)因素水平

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1　輻射溫度對(duì)金絲桃苷提取率的影響Fig. 1　Effects of radiation temperature on the extraction rate of hyperoside

2.1.1輻射溫度對(duì)金絲桃苷提取率的影響。由圖1可知，隨輻射溫度增加，金絲桃苷提取率逐漸升高，繼續(xù)升高輻射溫度對(duì)金絲桃苷提取率提高不明顯。因此，選用50 ℃作為輻射溫度的最優(yōu)值。

2.1.2微波功率對(duì)金絲桃苷提取率的影響。由圖2可知，在微波功率為500 W之前，隨微波功率增加，金絲桃苷提取率逐漸升高，繼續(xù)升高微波功率超過500 W之后，金絲桃苷提取率進(jìn)入平臺(tái)期。因此，選用500 W作為微波功率的最優(yōu)值。

圖2　微波功率對(duì)金絲桃苷提取率的影響Fig. 2　Effects of microwave power on the extraction rate of hyperoside

2.1.3微波輻射時(shí)間對(duì)金絲桃苷提取率的影響。由圖3可知，隨著微波輻射時(shí)間的增加，金絲桃苷提取率逐漸升高，當(dāng)達(dá)到9 min時(shí)，金絲桃苷提取率達(dá)最大；再增加輻射時(shí)間，金絲桃苷提取率下降。因此，輻射時(shí)間為9 min是最優(yōu)值。

2.1.4料液比對(duì)金絲桃苷提取率的影響。由圖4可知，隨著料液比的增加，金絲桃苷提取率逐漸升高，當(dāng)料液比達(dá)1∶20時(shí)，金絲桃苷提取率達(dá)最大；料液比繼續(xù)增大時(shí)，金絲桃苷提取率增加不明顯。因此，料液比優(yōu)選為1∶20。

圖3　微波輻射時(shí)間對(duì)金絲桃苷提取率的影響Fig. 3　Effects of microwave radiation time on the extraction rate of hyperoside

圖4　料液比對(duì)金絲桃苷提取率的影響Fig. 4　 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of hyperoside

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果由表2可知,輻射溫度(A)、微波功率(B)、微波輻射時(shí)間(C)、料液比(D)4個(gè)因素對(duì)金絲桃苷提取率的影響程度依次為輻射溫度(A)>微波功率(B)>料液比(D)>微波輻射時(shí)間(C)，得出最優(yōu)工藝為A2B1C3D3。

對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，因素A(輻射溫度)和因素B(微波功率)的F值均介于F0.01(2，2)和F0.05(2，2)之間， 即0.010.10，料液比對(duì)金絲桃苷的提取率無(wú)顯著性影響。

綜上所述,微波法提取貫葉連翹中金絲桃苷的最佳工藝條件為輻射溫度50 ℃、微波功率500 W、微波輻射時(shí)間9 min、料液比1∶20。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

3結(jié)論與討論

應(yīng)用微波技術(shù)提取貫葉連翹中的金絲桃苷，以金絲桃苷提取率為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法考察輻射溫度、微波功率、微波輻射時(shí)間及料液比對(duì)貫葉連翹中金絲桃苷提取率的影響，建立微波提取貫葉連翹中金絲桃苷的最佳工藝，結(jié)果表明，貫葉連翹微波提取金絲桃苷的工藝所選擇的4個(gè)影響因素對(duì)金絲桃苷提取率的影響程度依次為輻射溫度>微波功率>料液比>微波輻射時(shí)間，微波提取金絲桃苷的最優(yōu)工藝為輻射溫度50 ℃、微波功率500 W、微波輻射時(shí)間9 min、料液比1∶20。該試驗(yàn)得到的微波提取工藝條件可靠、穩(wěn)定性好，可用于貫葉連翹中金絲桃苷的提取。

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摘要[目的]優(yōu)選貫葉連翹中金絲桃苷微波提取工藝。[方法]以金絲桃苷提取率為考核指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法考察輻射溫度、微波功率、微波輻射時(shí)間及料液比對(duì)貫葉連翹中金絲桃苷提取率的影響，建立微波提取貫葉連翹中金絲桃苷的最佳工藝。[結(jié)果]微波提取金絲桃苷的最佳工藝條件為輻射溫度50 ℃、微波功率500 W、微波輻射時(shí)間9 min及料液比1∶20。[結(jié)論]通過以上試驗(yàn)得到的微波提取工藝條件可靠，穩(wěn)定性好，可用于貫葉連翹中金絲桃苷的提取。

關(guān)鍵詞貫葉連翹；金絲桃苷；微波提?。徽辉囼?yàn)

Optimization of Microwave Extraction Process of Hyperoside by Orthogonal Test

HU Xiao-yan1, XU Lei1，LI Bo-wen2(1. Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., Xuzhou, Jangsu 221004; 2.Shanghai Hile Bio-technology Co., Ltd., Shanghai 201403)

Abstract[Objective] To optimize the optimal microwave extraction process for hyperoside fromHypericumperforatumL. [Method] With the extraction rate of hyperoside as the evaluation index, effects of factors were studied in orthogonal test, such as radiation temperature, microwave power, microwave radiation time and solid-liquid ratio. [Result] The optimal extraction technology for microwave extraction process of hyperoside fromH.perforatumwere established, which was 50 ℃ radiation temperature, 500 W microwave power, 9 min radiation time, and 1∶20 solid-liquid ratio. [Conclusion] This extraction technology was reliable and stable, and was suitable for the extraction of hyperoside fromH.perforatum.

Key wordsHypericumperforatumL.; Hyperoside; Microwave extraction; Orthogonal test

收稿日期2015-12-07

作者簡(jiǎn)介胡小艷(1980- )，女，陜西西安人，工程師，博士，從事新藥開發(fā)研究。

中圖分類號(hào)S 567

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)01-165-03