張飛飛， 王亞萍， 姚小華， 仲山民， 費(fèi)學(xué)謙

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江富陽(yáng) 311400；2.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安 311300)

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油茶籽及其餅粕對(duì)黃曲霉的拮抗作用

張飛飛1,2， 王亞萍1*， 姚小華1， 仲山民2， 費(fèi)學(xué)謙1

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江富陽(yáng) 311400；2.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安 311300)

油茶是我國(guó)南方地區(qū)主要的木本油料作物[1]，油茶籽可以提取得到油茶籽油，因其具有重要的保健功能而深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。但是油茶籽在儲(chǔ)存、運(yùn)輸和加工過(guò)程中卻存在著被有毒有害物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)[3]，在這一過(guò)程中黃曲霉毒素因其致癌性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定而備受關(guān)注。黃曲霉毒素多存在于霉變的糧油制品中[4]，為晶體物質(zhì)，易溶于氯仿、甲醇和二甲基亞砜等中等極性溶劑，能溶于水，在紫外光照射下產(chǎn)生熒光。農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉毒素主要以4種常見(jiàn)形式污染食品，即黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)，其中，以AFB1最為常見(jiàn)，毒性最強(qiáng)[5]。

筆者以油茶籽及其餅粕為試材，采用不同極性的溶劑進(jìn)行提取，對(duì)所得粗提物抑制黃曲霉生長(zhǎng)的效果進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，其目的就是要從中篩選出對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)有較好抑制效果的粗提物，并掌握其提取工藝與條件，為進(jìn)一步分離與提純，了解并掌握其具體的功效成分與作用機(jī)理，進(jìn)而為油茶生產(chǎn)實(shí)踐與加工利用中更好地預(yù)防黃曲霉的污染，有效降低黃曲霉毒素對(duì)人體的危害等提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料原料：油茶籽，取自于浙江地區(qū)的普通油茶籽，新鮮，完整，無(wú)霉變腐爛等；油茶粕，為油茶籽榨油后剩余的油茶餅；黃豆，購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，產(chǎn)于浙江地區(qū)的普通黃豆，新鮮，完整，無(wú)霉變腐爛等；花生，購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，產(chǎn)于浙江地區(qū)的普通花生，新鮮，完整，無(wú)霉變腐爛等。

主要儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A，上海亞榮生化儀器廠；普通水浴鍋；生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BSC-1000ⅡA2生物安全柜，蘇州蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；Agilent1290高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；LDZF-30KB立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2方法

1.2.1人工接種黃曲霉菌的試驗(yàn)。分別稱取油茶籽、油茶粕、黃豆、花生4種材料，放置于熱風(fēng)烘干箱中60 ℃烘干12 h,放入干燥器中冷卻至室溫，各稱取300 g，粉碎過(guò)20目篩，然后用濕熱滅菌法滅菌，接種黃曲霉(用配制好的黃曲霉孢子懸浮液進(jìn)行接種，黃曲霉孢子懸浮液的濃度為1×106CFU/mL，每個(gè)平板接種黃曲霉孢子懸浮液5 mL)。在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d，每4 d取樣1次，進(jìn)行觀察，觀察4種試驗(yàn)材料接種黃曲霉后的感染及生長(zhǎng)情況，并測(cè)定各樣品中AFB1的含量。

1.2.2油茶籽和油茶粕粗提物抑制黃曲霉生長(zhǎng)的試驗(yàn)。選取無(wú)霉變感染的油茶籽、脫脂后的油茶粕于60 ℃烘干，粉碎后過(guò)20目篩，分別用不同極性的溶劑(乙醚、80%乙醇、水)加熱回流提取。料液比1∶5 g/mL，每種溶劑重復(fù)提取3次，時(shí)間分別為3、2、1 h，將每種溶劑3次所得提取液合并、濃縮，將提取液放置于鋁盒中，在熱風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干至恒重，稱重，計(jì)算粗提物得率。

用無(wú)菌水將各油茶籽粗提物配制成400 mg/mL的水溶液。用滅菌槍頭吸取黃曲霉孢子懸液0.5 mL，均勻涂布于PDA平板上，每個(gè)平板上放直徑6 mm的無(wú)菌濾紙片3片，每個(gè)紙片滴加0.05 mL粗提物，每處理做3個(gè)重復(fù)。

1.2.3檢測(cè)方法。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2由國(guó)家林業(yè)局經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1不同試樣感染黃曲霉毒素的情況黃曲霉一般在25～30 ℃生長(zhǎng)較好[6]，以油茶籽、油茶粕為材料，以黃豆、花生為對(duì)照，人工接種黃曲霉，在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每4 d取樣1次，及時(shí)對(duì)所取樣品所含AFB1的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1中可以看出，在人為接種黃曲霉的情況下，油茶籽和油茶粕均未產(chǎn)生黃曲霉毒素B1，花生的5個(gè)批次樣品中都產(chǎn)生了黃曲霉毒素B1。從表1可知，花生中AFB1的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，呈上升趨勢(shì)；油茶籽和油茶粕在5次提取的樣品中并未檢測(cè)到AFB1。筆者推測(cè)認(rèn)為，油茶籽和油茶粕中含有某些成分對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用，進(jìn)而減少AFB1的產(chǎn)生，甚至是不產(chǎn)生AFB1。

表1　不同試樣產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的含量

注：AFB1的檢出限為1.0 μg/kg。

Note: Detection limit of AFB1 was 1.0 μg/kg.

2.2不同溶劑提取對(duì)油茶籽和油茶粕粗提物得率的影響按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，將油茶籽粉、油茶粕粉放置于烘箱中60 ℃烘干，準(zhǔn)確稱量烘干的油茶籽和油茶粕各40 g，各3份，分別置于不同的提取瓶中，分別用純凈水、80%乙醇、乙醚作為提取劑，溶劑加入量為200 mL，然后均采用熱回流提取法[7]提取3次，提取的時(shí)間分別為3、2和1 h，將3次所得提取液混合，并置于50 ℃烘箱中烘干至恒重，稱量，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　不同溶劑提取油茶籽、油茶粕粗提物的得率

由表2可知，采用不同極性的溶劑來(lái)提取油茶籽、油茶粕中的粗提物，其得率是完全不同的，有明顯差異。其中，用乙醚提取的油茶籽粗提物的得率最高，達(dá)57.74%；其次是用純凈水提取的油茶籽粗提物的得率，可達(dá)38.90%；油茶籽80%乙醇的提取率較低，為18.42%；最低的是用乙醚作為提取劑，提取油茶粕中的粗提物，其得率僅為0.27%；而油茶粕中的粗提物，不論是用純凈水提取，還是用80%乙醇提取，其得率均在22%左右。

2.3油茶籽和油茶粕粗提物對(duì)黃曲霉的抑制效果按“1.2.2”的方法測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率[8]，具體結(jié)果如表3所示。

從表3中可以看出，油茶籽和油茶粕的水提物對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)有較好的抑制效果，抑菌率分別達(dá)到88.87%和87.96%，兩者的差異并不明顯，均可用于抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，相對(duì)來(lái)說(shuō)，采用油茶粕的水提物更為經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。油茶籽的乙醚提取物對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)也有一定的抑制作用，抑菌率可達(dá)61.11%，也可適當(dāng)予以應(yīng)用。油茶籽和油茶粕的乙醇提取物，以及油茶粕的乙醚提取物對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)都沒(méi)有抑制效果。

從圖1、2可以看出，在恒溫培養(yǎng)4 d后，PDA平板上的黃曲霉已經(jīng)大量生長(zhǎng)，而在有粗提物的濾紙片的周?chē)?，只生長(zhǎng)了少量的白色菌絲，說(shuō)明油茶籽和油茶粕的水提物能夠明顯減緩黃曲霉的生長(zhǎng)。

表3　油茶籽和油茶粕粗提物對(duì)黃曲霉的抑制效果

注：“/”為沒(méi)有抑制效果。

Note: “/” indicated no inhibitory effects.

圖1　油茶籽水提取物抑制黃曲霉的效果Fig. 1　Inhibitory effects of water extracts from camellia seed on Aspergillus flavus

圖2　油茶粕水提取物抑制黃曲霉的效果Fig. 2 Inhibitory effects of water extracts from seed cake on Aspergillus flavus

從圖3可以看出，油茶籽的乙醚提取物在培養(yǎng)皿中也形成較明顯的抑菌圈，表明它同樣能抑制黃曲霉的生長(zhǎng)。

圖3　油茶籽乙醚提取物抑制黃曲霉的效果Fig. 3　Inhibitory effects of diethyl ether extracts from camellia seed on Aspergillus flavus

至于上述這3種粗提物中究竟是哪一種活性物質(zhì)在起抑菌作用，還是多種活性物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，筆者認(rèn)為還需要進(jìn)一步的分離提純，并進(jìn)行大量的驗(yàn)證試驗(yàn)才能逐步確定。

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在人為接種黃曲霉的情況下，油茶籽、油茶粕均未產(chǎn)生黃曲霉毒素B1，表明油茶籽、油茶粕都具有一定的抗黃曲霉生長(zhǎng)與產(chǎn)毒作用。

研究結(jié)果表明，采用不同極性的溶劑來(lái)提取油茶籽、油茶粕中的粗提物，其得率是完全不同的，有明顯差異。其中，用乙醚提取的油茶籽粗提物的得率最高，達(dá)57.74%；其次是用純凈水提取的油茶籽粗提物的得率，可達(dá)38.90%；油茶籽80%乙醇的提取率較低，為18.42%；最低的是用乙醚作為提取劑提取油茶粕中的粗提物，其得率僅為0.27%；而油茶粕中的粗提物，不論是用純凈水提取，還是用80%乙醇提取，其得率均在22%左右。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用不同溶劑來(lái)提取油茶籽、油茶粕所得的不同粗提物，對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)的抑制效果截然不同。其中，油茶籽、油茶粕的水提物對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)的抑制效果較好，其抑菌率分別達(dá)到88.87%和87.96%，兩者的差異并不明顯；油茶籽的乙醚提取物對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)也有一定的抑制作用，其抑菌率可達(dá)61.11%；而油茶籽、油茶粕的乙醇提取物，以及油茶粕的乙醚提取物對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)都沒(méi)有抑制效果。

從油茶籽、油茶粕中提取所得的不同粗提物內(nèi)，對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)起抑制作用的成分，到底是哪一種活性物質(zhì)，還是多種活性物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，還有待于做進(jìn)一步的分離提純，及大量的驗(yàn)證試驗(yàn)。

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摘要[目的] 從油茶籽及其餅粕中篩選出對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)有較好抑制效果的粗提物，并掌握其提取工藝與條件。[方法]以油茶籽及其餅粕為試材，采用不同極性的溶劑進(jìn)行提取，對(duì)所得粗提物抑制黃曲霉生長(zhǎng)的效果進(jìn)行系統(tǒng)的研究。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，油茶籽、油茶粕都具有一定的抗黃曲霉生長(zhǎng)與產(chǎn)毒作用。用不同溶劑提取油茶籽、油茶粕中的粗提物，其得率是有明顯差異的，用乙醚提取的油茶籽粗提物的得率最高，達(dá)57.74%；其次是用純凈水提取的油茶籽粗提物的得率，可達(dá)38.90%；最低的是用乙醚作為提取劑提取的油茶粕粗提物，其得率僅為0.27%。粗提物不同，對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)的抑制效果也不同，其中，油茶籽、油茶粕的水提物對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)的抑制效果較好，其抑菌率分別達(dá)到88.87%和87.96%；油茶籽的乙醚提取物也有一定的抑制作用，其抑菌率可達(dá)61.11%；而油茶籽、油茶粕的乙醇提取物，以及油茶粕的乙醚提取物對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)都沒(méi)有抑制效果。[結(jié)論] 研究可為油茶生產(chǎn)與加工利用中更好地預(yù)防黃曲霉的污染，有效降低黃曲霉毒素對(duì)人體的危害等提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞油茶籽；油茶粕；黃曲霉；抑制

Antagonistic Effects of Camellia Seed and Seed Cake onAspergillusflavus

ZHANG Fei-fei1,2, WANG Ya-ping1*, YAO Xiao-hua1et al (1. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang, Zhejiang 311400; 2. School of Agricultural and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin’an, Zhejiang 311300)

Abstract[Objective] To screen the crude extracts from camellia seed and seed cake which had relatively good inhibitory effects on the growth ofAspergillusflavus, and to grasp the extraction technology and conditions. [Method] With camellia seed and seed cake as the research materials, extraction was carried out by solvents with different polarities. Systematic study of the antagonistic effects of camellia seed and seed cake onA.flavuswas carried out. [Result] Both camellia seed and seed cake had certain effects of toxin production and resistance effects onA.flavusgrowth. The extraction rates of crude extracts from camellia seed and seed cake varied greatly by different solvents, showing significant differences. Among them, crude extracts from camellia seed by diethyl ether had the maximum extraction rate (57.74%), followed with the crude extracts from camellia seed by purified water (38.90%). Crude extracts extracted by diethyl ether had the minimum extraction rate, which was only 0.27%. Different crude extracts showed different inhibitory effects on the growth ofA.flavus. Among them, water extracts from camellia seed and seed cake had relatively good inhibitory effects on the growth ofA.flavus. And their inhibitory rates reached 88.87% and 87.96%, respectively. Extracts from camellia seed by diethyl ether also had certain inhibitory effects, and the inhibitory rate reached 61.11%. Extracts from camellia seed and seed cake by ethanol showed no inhibitory effects on the growth ofA.flavus, as well as the extracts from seed cake by diethyl ether. [Conclusion] This research provides certain theoretical foundation for the prevention ofA.flavuspollution during production and process of camellia, and effectively reduces the damage ofA.flavusto human body.

Key wordsCamellia seed; Seed cake;A.flavus; Inhibition

收稿日期2015-10-30

作者簡(jiǎn)介張飛飛(1988- )，女，山東五蓮人，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品的加工與利用研究。

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400577)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CAFYBB2014QB036)。

中圖分類號(hào)S 789.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)01-108-04