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·基礎(chǔ)研究論著·

作者單位：510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科

1型糖尿病小鼠腸道潘氏細(xì)胞的殺菌功能改變

1型糖尿病是以慢性血糖升高為特征的代謝性疾病，主要由胰島B細(xì)胞破壞，胰島素絕對缺乏引起[1]。近年來，越來越多的臨床調(diào)查研究提示1型糖尿病患者發(fā)生腸道細(xì)菌、病毒和真菌等病原體感染的幾率顯著增加[2-4]。在正常機體中，腸道黏膜的屏障功能是維持機體內(nèi)外穩(wěn)態(tài)的重要基礎(chǔ)。其中，腸道黏膜上皮隱窩底部的潘氏細(xì)胞所分泌的溶菌酶在保持腸道菌群平衡以及抵御病原生物侵襲等方面起著極其重要的作用[5-6]。

研究顯示，在腸道潘氏細(xì)胞的分化、成熟過程中主要受Wnt和Notch信號通路調(diào)控[7]。本實驗組的前期研究發(fā)現(xiàn)，包括潘氏細(xì)胞在內(nèi)，1型糖尿病小鼠的各種腸上皮細(xì)胞均存在分化比例的改變[8]。然而，在1型糖尿病的病理狀態(tài)下，機體中的胰島素絕對缺乏，除了誘發(fā)腸上皮細(xì)胞分化比例異常，是否影響潘氏細(xì)胞的成熟及其殺菌功能，目前相關(guān)報道不多，還需要進(jìn)一步研究探討。因此，本研究旨在探討在1型糖尿病小鼠模型中腸道潘氏細(xì)胞殺菌功能的改變，以及恢復(fù)胰島素水平對其功能的影響，為糖尿病腸道感染的相關(guān)研究提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑

鏈脲菌素購自Sigma公司；檸檬酸購自廣州化學(xué)試劑廠；中性魚精蛋白胰島素購于諾和諾德公司；ELISA試驗盒購于Merck Millipore公司；大腸埃希菌K12 ER2738菌株購于New England Biolabs公司，兔抗小鼠溶菌酶抗體購于Santa Cruz公司；免疫組織化學(xué)檢查SP試劑盒購于邁新公司。

二、實驗動物

實驗動物為C57BL/6J小鼠，共30只，雌雄各半，8周齡，購于中山大學(xué)北校區(qū)實驗動物中心，在中山大學(xué)北校區(qū)實驗中心屏障環(huán)境中飼養(yǎng)。所有有關(guān)動物的實驗過程均在中山大學(xué)實驗動物倫理委員會的監(jiān)督指導(dǎo)下完成，符合實驗動物倫理學(xué)要求。

三、實驗方法

1.糖尿病小鼠模型的建立

將30只C57BL/6J小鼠隨機分為3組，每組10只：正常對照組(Control組)、1型糖尿病組(UDM組)、胰島素治療組(IDM組)。1%鏈脲菌素溶液由無菌0.1 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=4.5)溶解鏈脲菌素制成，并立即對UDM及IDM組小鼠行腹腔內(nèi)注射，劑量為70 mg/kg，1次/日，連續(xù)5 d。Control組給予相同體積的無菌0.1 mol/L檸檬酸緩沖液腹腔內(nèi)注射，1次/日，連續(xù)5 d。1型糖尿病模型建模成功的條件為長期維持血糖大于16.7 mmol/L[9-10]。IDM組則給予造模成功的糖尿病小鼠皮下注射0.08 IU中性魚精蛋白胰島素，每日2次，直至實驗結(jié)束[11-12]。第14周處死小鼠，沿腹部正中線行切開腹腔，取出靠近回腸末端10 cm片段進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.ELISA檢測血漿胰島素水平

于試驗終點時，使用心臟穿刺取血的方法抽取其血液進(jìn)行離心(2 000×g, 4℃，15 min)，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測各組血漿胰島素水平。

3.菌落培養(yǎng)法評估腸道細(xì)菌增殖情況

取腸道片段進(jìn)行研磨、稀釋，然后取相同體積稀釋液接種于培養(yǎng)平板。對于需氧細(xì)菌的培養(yǎng)，稀釋液接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板，在37℃的有氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h；對于厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)，稀釋液接種于兔血瓊脂平板，在37℃的無氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h。最后平板上的菌落克隆數(shù)目計數(shù)，換算為單位質(zhì)量腸道細(xì)菌總數(shù)(CFUs)。

4. 菌落培養(yǎng)法評估腸道對大腸埃希菌的清除能力

在第14周，用灌胃法注入0.1 ml碳酸氫鈉溶液(0.1 M)，然后立即注入0.1 ml的大腸埃希菌溶液(2×1010CFUs)。該大腸桿菌為K12 ER2738菌株，對四環(huán)素耐藥。3 h后殺死小鼠，收集腸道組織，進(jìn)行研磨、稀釋，然后取相同體積稀釋液接種于含20 mg/L四環(huán)素的培養(yǎng)平板。統(tǒng)計平板上的細(xì)菌克隆數(shù)，計數(shù)單位體積細(xì)菌總數(shù)。

5.免疫組織化學(xué)法檢測腸上皮溶菌酶的定性表達(dá)

組織切片行脫蠟、水化后，過氧化酶阻斷劑孵育10 min，非免疫羊血清孵育10 min，溶菌酶一抗(1∶2 500稀釋)4℃孵育過夜，二抗37℃孵育30 min，鏈霉素抗生物素過氧化物酶孵育10 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min，磷酸鹽緩沖液終止顯色，蘇木素復(fù)染30 s。封片后光鏡下觀察溶菌酶陽性細(xì)胞的位置及表達(dá)情況。由2位研究者獨立閱片，在400倍的觀察條件下，計算視野中每個完整小腸隱窩單位溶菌酶陽性細(xì)胞的數(shù)目。隨機選擇15個視野計數(shù)分析，取其平均值。

6.蛋白免疫印跡法檢測腸上皮溶菌酶的定量表達(dá)

腸組織研磨后用RIPA緩沖液提取蛋白，提取液在12%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。膜在溶菌酶一抗(1∶2 500稀釋)或β-actin一抗(1∶2 000稀釋)中4℃輕搖孵育過夜，在辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育30 min。最后加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶。運用Glyko BandScan 5.0分析蛋白條帶的灰度，以β-actin為內(nèi)參。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、Control組、UDM組、IDM組的血糖和血漿胰島素水平比較

與Control組比較，UDM組血糖明顯升高(P<0.01)；接受胰島素治療可使IDM組小鼠血糖恢復(fù)正常，與Control組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.776，P>0.05)。UDM組血漿胰島素水平較Control組明顯下降(P<0.01)，而在胰島素替代治療的IDM組小鼠中，其胰島素水平明顯升高，與Control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.778，P>0.05)，見表1。

表1Control組、UDM組、IDM組的

注：與Control組比較，t血糖=20.170,t血漿胰島素=12.332，aP<0.01

二、Control組、UDM組、IDM組的需氧菌總數(shù)、厭氧菌總數(shù)比較

與Control組比較， UDM組小鼠回腸末端的需氧菌總數(shù)多(P<0.05)；UDM組厭氧菌總數(shù)也較Control組多(P<0.05)；胰島素治療后的IDM組腸道需氧菌和厭氧菌總數(shù)均低于UDM組，與Control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t需氧菌=0.162，t厭氧菌=0.305，P均>0.05)，見表2。

表2Control組、UDM組、IDM組的

注：與Control組比較，t需氧菌= 2.599，t厭氧菌=2.220，aP<0.05

運用灌胃法注入耐四環(huán)素的大腸埃希菌K12 ER2738菌株，該菌株在UDM組中的存活數(shù)明顯高于Control組及胰島素治療后的IDM組(圖1；P<0.05)，而IDM組同Control組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。上述結(jié)果提示，糖尿病小鼠的回腸末段細(xì)菌增多，抑菌能力減低。

圖1　Control組、UDM組、IDM組大腸埃希菌

三、糖尿病小鼠回腸末端潘氏細(xì)胞溶菌酶表達(dá)減低

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，溶菌酶分子主要表達(dá)在腸隱窩底部的潘氏細(xì)胞的胞漿中，呈黃色或棕黃色顆粒(圖2)。UDM組小腸上皮平均每個隱窩的溶菌酶陽性細(xì)胞數(shù)為(5.75±1.00)個，Control組為(4.46±0.96)個，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.013，P< 0.05)；而IDM組和Control組對比無統(tǒng)計學(xué)差異[(4.39±0.85)個vs.(4.46±0.96)個,t=0.151，P>0.05]。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，UDM組的溶菌酶表達(dá)強度低于Control組(0.39±0.16vs. 0.79 ± 0.12，t=6.018,P< 0.01)；而IDM組和Control組對比無統(tǒng)計學(xué)差異(0.79 ± 0.16vs. 0.79 ± 0.12，t=0.081，P> 0.05)，見圖3。

圖2　Control組、UDM組、IDM組回腸末端潘氏細(xì)胞溶菌酶表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色)

圖3　Control組、UDM組、IDM組小鼠腸道

討論

糖尿病腸道感染是糖尿病患者的常見并發(fā)癥之一。近年來，一系列臨床調(diào)查研究提示，1型糖尿病患者更容易發(fā)生腸道細(xì)菌、真菌、病毒等病原體感染，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、吸收不良等臨床表現(xiàn)，也可以呈無癥狀的隱性感染狀態(tài)[1-4]。然而，其中的具體機制尚未完全闡明，目前考慮可能與內(nèi)臟神經(jīng)病變、胃腸運動障礙、腸道激素分泌紊亂等多個因素有關(guān)[13]。

Roza等[14]研究發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病大鼠腸道細(xì)菌負(fù)荷增加，并且出現(xiàn)異常的細(xì)菌菌株，提示在腸道感染發(fā)生前可能已經(jīng)存在腸道菌群的紊亂及細(xì)菌的過度生長。本次研究的結(jié)果表明，1型糖尿病小鼠在血糖持續(xù)升高后出現(xiàn)了回腸末端需氧菌和厭氧菌數(shù)量的明顯增加，這與Roza等[14]研究相符，同時提示1型糖尿病小鼠可能存在腸道抑菌功能的下降，與其易發(fā)生腸道細(xì)菌感染有關(guān)。

為了評價1型糖尿病小鼠腸道的易感性，本課題組采用了K12 ER2738大腸埃希菌的菌株進(jìn)行灌胃，并收集糞便進(jìn)行四環(huán)素下的糞便細(xì)菌培養(yǎng)，這一方法可以有效去除腸道既有菌量、菌群的差異對研究結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，耐四環(huán)素的大腸埃希菌更容易在血糖升高的UDM組1型糖尿病小鼠腸道中存活。這進(jìn)一步證明了1型糖尿病小鼠腸道對細(xì)菌的防御功能下降，清除病原體能力下降，對外來病原體的易感性增加。

腸道黏膜上皮隱窩底部的潘氏細(xì)胞可以產(chǎn)生及分泌溶菌酶，這一功能蛋白在局部腸道抑菌和防御作用方面發(fā)揮著重要的作用。本課題組既往的研究表明，1型糖尿病小鼠模型中腸道潘氏細(xì)胞數(shù)量增加，同時Notch/Hes1通路的表達(dá)減低提示其分化受抑制，但對其合成、分泌溶菌酶的狀態(tài)及其抑菌功能未行進(jìn)一步探討[8]。本次研究表明，潘氏細(xì)胞在持續(xù)血糖升高后的1型糖尿病小鼠回腸末端的數(shù)量稍增加，同時，其產(chǎn)生及分泌的溶菌酶卻明顯減低。這一數(shù)量增加、功能減低的矛盾狀態(tài)，提示1型糖尿病對小鼠腸道潘氏細(xì)胞的分化產(chǎn)生了抑制作用。

上述的潘氏細(xì)胞功能異常是否與1型糖尿病的低胰島素水平有關(guān)，目前尚不清楚。本課題組采用的1型糖尿病小鼠模型原理是鏈脲菌素破壞胰島細(xì)胞，導(dǎo)致其分泌胰島素不足。結(jié)果顯示，UDM組小鼠的胰島素水平明顯減低，而胰島素替代治療后的IDM組可使胰島素水平恢復(fù)至正常對照小鼠的水平。后續(xù)的觀察發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病小鼠接受胰島素替代治療后，潘氏細(xì)胞的數(shù)目及其溶菌酶表達(dá)水平均可恢復(fù)至正常狀態(tài)。同時，腸道細(xì)菌菌量及K12 ER2738大腸埃希菌的抑制作用也與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，提示胰島素替代治療恢復(fù)血糖水平后腸道局部的抑菌能力也得到恢復(fù)。這些結(jié)果證明潘氏細(xì)胞的功能障礙可以被胰島素替代治療所改善，同時，隨著潘氏細(xì)胞功能的恢復(fù)，腸道的防御能力也得以提高。

綜上所述，1型糖尿病小鼠腸道局部防御能力下降與潘氏細(xì)胞分泌溶菌酶減低有關(guān)，而胰島素替代治療可以恢復(fù)潘氏細(xì)胞溶菌酶的表達(dá)及腸道的抑菌能力。

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(本文編輯：楊江瑜)

楊洪生盧錫基于濤歐陽慧陳其奎

【摘要】目的探討1型糖尿病小鼠腸道潘氏細(xì)胞殺菌功能的改變。方法采用腹腔注射鏈脲菌素的方法誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠模型，8周齡小鼠分為正常對照組(Control組)、糖尿病組(UDM組)和糖尿病胰島素治療組(IDM組)。采用菌落培養(yǎng)法評估腸道細(xì)菌增殖情況及對外來大腸埃希菌的殺滅能力。利用免疫組織化學(xué)法和蛋白免疫印跡法檢測潘氏細(xì)胞內(nèi)溶菌酶的表達(dá)情況。結(jié)果與Control組比較，UDM組回腸末端有氧細(xì)菌總量增加(UDM組：5.66±0.80 lg CFUs/g，Control組：4.70±0.81 lg CFUs/g，P<0.05)，厭氧細(xì)菌總量也增加(UDM組：6.71±1.37 lg CFUs/g，Control組：5.25±1.16 lg CFUs/g，P<0.05)；UDM組腸上皮每個隱窩內(nèi)潘氏細(xì)胞數(shù)目增多(UDM組：5.75±1.00個，Control組：4.46±0.96個，P<0.05)，但溶菌酶的蛋白質(zhì)表達(dá)下降。IDM組與Control組比較，潘氏細(xì)胞數(shù)目、溶菌酶的蛋白質(zhì)表達(dá)、腸道的細(xì)菌總量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論1型糖尿病小鼠腸道防御能力下降，與潘氏細(xì)胞分泌溶菌酶不足有關(guān)，而胰島素替代治療可以恢復(fù)潘氏細(xì)胞溶菌酶的表達(dá)及腸道的防御能力。

【關(guān)鍵詞】1型糖尿病；潘氏細(xì)胞；溶菌酶；胰島素；腸道細(xì)菌

Changes in bactericidal function of intestinal Paneth cells in type 1 diabetic miceYangHongsheng,LuXiji,YuTao,OuyangHui,ChenQikui.DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

Correspondingauthor，YuTao,E-mail:yutao2014@126.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes in the bactericidal function of intestinal Paneth cells in type 1 diabetes mellitus (T1DM) mouse models. MethodsT1DM mouse models were established by intraperitoneal injection of streptozocin (STZ). The 8-week-aged mice were divided into the control(Control), STZ-induced diabetic mice (UDM) and insulin-treated diabetic mice (IDM) groups. Bacterial culture was performed to evaluate the bacterial proliferation in the intestine and the bactericidal ability to eliminate foreign Escherichia coli. The expression level of lysozyme in intestinal Paneth cells was detected by immunohistochemistry and western blot. ResultsCompared to the Control group, the aerobe load of terminal ileum in the UDM group was significantly increased (UDM group：5.66±0.80 lg CFUs/g，Control group：4.70±0.81 lg CFUs/g，P<0.05), so was the anaerobe load (UDM group：6.71±1.37 lg CFUs/g，Control group：5.25±1.16 lg CFUs/g，P<0.05) and the quantity of Paneth cells in each crypt of intestinal epithelial cells (UDM group：5.75±1.00 per crypt，Control group：4.46±0.96 per crypt，P< 0.05). However, the expression level of lysozyme in the UDM group was decreased compared with that in the control group. No significant difference was noted between the IDM and control groups in terms of the quantity of Paneth cells, the expression level of lysozyme and overall bacterial load in the intestine. ConclusionsThe intestinal bactericidal function of the T1DM mice was decreased, which may result from the insufficient secretion of lysozyme by the Paneth cells. The insulin treatment can enhance the expression of lysozyme and restore the bactericidal function of the intestine in the T1DM mice.

【Key words】Type 1 diabetes mellitus; Paneth cells; Lysozyme; Insulin; Intestinal microbiota

收稿日期：(2015-08-06)

通訊作者，于濤，E-mail：yutao2014@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81370475)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.01.005