鄭華++計(jì)可為++周蓮清++孟春梅++蘇志恒

【摘要】 目的：探索甜茶素對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)INS -1細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。方法：MTT法檢測正常對(duì)照組、棕櫚酸模型組、不同濃度甜茶素組細(xì)胞存活率，透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，免疫電鏡觀察各組細(xì)胞色素C的易位表達(dá)。結(jié)果：不同濃度甜茶素對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的INS -1細(xì)胞具有保護(hù)作用，超微結(jié)構(gòu)保存較好；模型組細(xì)胞凋亡增多且超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，Cyt C蛋白從線粒體釋放人細(xì)胞質(zhì)。結(jié)論：甜茶素可以提高棕櫚酸誘導(dǎo)INS-1損傷的細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其機(jī)制可能與抑制棕櫚酸引起的氧化應(yīng)激和阻礙Cyt C從線粒體轉(zhuǎn)位入細(xì)胞質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 甜茶素；棕櫚酸；INS -1細(xì)胞；超微結(jié)構(gòu)；細(xì)胞色素C

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517（2015）24-0016-04

廣西甜茶（Rubus suavissimus S.Lee）為薔薇科懸鉤子屬多年生有刺灌木，民間主要用于糖尿病和肥胖癥的治療，甜茶素是甜茶葉中最具價(jià)值的成分。近年有研究報(bào)道胰島素抵抗導(dǎo)致的血脂水平紊亂可使胰島B細(xì)胞處于持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，最終可導(dǎo)致胰島B細(xì)胞凋亡。有研究表明，甜茶素能顯著降低高脂飲食模型大鼠血糖水平，但具體作用機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道?；诖?，我們以棕櫚酸模擬機(jī)體胰島素抵抗所導(dǎo)致的高血脂產(chǎn)生的內(nèi)環(huán)境改變，并應(yīng)用透射電鏡和免疫電鏡技術(shù)，觀察甜茶素干預(yù)大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞INS-1后亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞色素C（Cy-tochrome C，Cyt C）表達(dá)的影響，探討甜茶素抑制脂毒性的作用機(jī)制，為開發(fā)防治糖尿病新藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株大鼠胰島細(xì)胞瘤INS-l細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，資源編號(hào)為3111 COOOICCC000378。

1.2 藥物與試劑棕櫚酸、甜茶素（Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；兔抗Cyt C多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；羊抗兔IgG膠體金lOnm（武漢博士德生物試劑有限公司）；LR White樹脂（英國RESIN公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 C0₂培養(yǎng)箱；- 20℃-80℃冰箱（日本Sanyo公司）；UC6徠卡超薄切片機(jī)；紫外線聚合箱（中鏡科儀公司）；H-7650透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.4 細(xì)胞模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組 取生長狀態(tài)良好的INS-1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，含3×10⁴個(gè)細(xì)胞，置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3h，使各孔細(xì)胞同步化。按隨機(jī)原則分為6組：①正常對(duì)照組，不加任何處理因素；②棕櫚酸模型組：在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)48h；③甜茶素干預(yù)組：在細(xì)胞培養(yǎng)基中先加入不同濃度（25、50、100、200μmol/L）的甜茶素培養(yǎng)48h，再加入終濃度為0.5 mmol/L棕櫚酸繼續(xù)培養(yǎng)48h。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞存活率的檢測 細(xì)胞存活率應(yīng)用MTT法檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h加入MTT（5g/L，每孔20μl）繼續(xù)孵育4h后，棄培養(yǎng)液，每孑L加入DMS0 150μl，振蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇492nm的波長，用酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔吸光值（A），記錄結(jié)果。計(jì)算存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組A值×100%）。

1.6 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)收集各組細(xì)胞，離心成團(tuán)，經(jīng)3%戊二醛前固定，鋨酸后固定，乙醇梯度脫水（50%、70%、80%、90%、），乙醇丙酮1：1（濃度為90%）脫水，lOO%丙酮脫水3次，用618包埋劑、DDSA、DBP、DMP-30調(diào)和劑滲透包埋，烘箱烤制（38℃12h，45℃12h，60℃48h），超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛分別染色Smin，日立H-7650電鏡下觀察。

1.7 免疫電鏡觀察Cyt C蛋白的分布收集各組細(xì)胞離心成團(tuán)，于4%多聚甲醛-0.5%戊二醛固定2h之后，4%甘氨酸封閉醛基30min，-20℃下依次30%、50%、70%乙醇脫水，在-20℃冰箱中依次用LR White樹脂+加速劑：70%乙醇（2：1）、100% LR White樹脂滲透，再用lOO% LRWhite樹脂滲透過夜。在4℃下用純的LR White樹酯包埋，在-20℃冰箱中用長紫外線（360nm）照射聚合72h，然后在室溫下繼續(xù)照射聚合48h。超薄切片，用鎳網(wǎng)撈片。對(duì)超薄切片進(jìn)行封閉非特異性結(jié)合的處理，室溫下5min，然后依次加入一抗孵育過夜，二抗膠體金孵育2h，經(jīng)PBS漂洗后常規(guī)染色，干燥待鏡。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.O統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用（x±s）表示，檢查方差齊性，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法），P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甜茶素對(duì)INS-1細(xì)胞存活率的影響

2.2 各組INS-I細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變 由圖1可知，正常對(duì)照組INS-l細(xì)胞胞質(zhì)見豐富的粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體，內(nèi)見多個(gè)胰島素分泌顆粒，線粒體膜完整，嵴清晰，核染色質(zhì)分布均勻。棕櫚酸組INS-l細(xì)胞胞質(zhì)線粒體腫脹疏松化、嵴斷裂，空泡樣變明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張嚴(yán)重，核糖體脫落，細(xì)胞核碎裂、核溶解，核染色質(zhì)邊集，凋亡小體生成，胰島素顆粒分泌減少；甜茶素50μmol/L組INS-1細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體較豐富，可見較多胰島素分泌顆粒，核膜完整，核染色質(zhì)分布較均勻，未見凋亡小體；甜茶素25μmol/l.和100μmol/L組可見lNS-l細(xì)胞粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基本正常，個(gè)別線粒體嵴不完整，胰島素分泌顆粒較多，未見凋亡小體，與棕櫚酸模型組比較，各用藥組INS-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善。

2.3

CytC蛋白在INS-1細(xì)胞中的分布由圖2可知，正常對(duì)照組可見INS-1細(xì)胞線粒體內(nèi)可見大量Cyt C蛋白表達(dá)，表現(xiàn)為有大量簇狀黑色膠體金顆粒分布于線粒體膜旁，而棕櫚酸模型組INS-l細(xì)胞線粒體里幾乎看不見膠體金顆粒，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相反，棕櫚酸模型組INS-1細(xì)胞在線粒體外的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多膠體金顆粒，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。甜茶素各劑量組INS-1細(xì)胞線粒體內(nèi)可見較多膠體金顆粒，線粒體外的細(xì)胞質(zhì)有少量膠體金顆粒，與棕櫚酸模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中以甜茶素50μmol/L組最為明顯。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)氧自由基代謝參與了糖尿病的發(fā)生與發(fā)展，高糖高脂對(duì)胰島p細(xì)胞有協(xié)同破壞作用，增高的血漿游離脂肪酸可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這種由游離脂肪酸引起的細(xì)胞凋亡稱為“脂性凋亡”。脂毒性的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生過多的氧自由基，啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的凋亡刺激因子，造成胰島細(xì)胞的不可逆凋亡。因此臨床上必須重視脂毒性對(duì)胰島細(xì)胞的損傷，尋找天然無毒的抗氧化劑，將有助于2型糖尿病的臨床防治。廣西甜茶（Rubus suavissirnus S，Lee）是最高甜度、低熱能且天然無毒的珍稀甜味植物，具有“藥、糖、茶”三重功效，是一種獲得美國FDA認(rèn)證的天然的糖類替代品和藥品。其主要成分甜茶素（rubusoside）是由斯替維醇和葡萄糖結(jié)合而成的四環(huán)二萜苷?，F(xiàn)代研究表明，甜茶素有一定的降血糖、降血脂和降血壓的作用，對(duì)肥胖癥、糖尿病、心血管病、高血壓等有一定療效。但以往的研究都是對(duì)模型動(dòng)物來進(jìn)行研究，并沒有從亞細(xì)胞角度來深入探索甜茶素的作用機(jī)制。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量。外部因素的刺激可導(dǎo)致線粒體功能下降，呼吸鏈斷裂，成為ROS生成的主要來源。調(diào)控細(xì)胞凋亡有三種途徑：線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。線粒體是多種促細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的靶點(diǎn)，同時(shí)也是細(xì)胞死亡通路的整合元件，被稱作細(xì)胞凋亡的生死開關(guān)，大多數(shù)凋亡刺激因子通過線粒體激活細(xì)胞凋亡途經(jīng)。因此，線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變和線粒體內(nèi)的蛋白表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。Cyt C是線粒體呼吸鏈中的一種電子傳遞體，作為一種促凋亡信號(hào)蛋白，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用川。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，對(duì)線粒體能量代謝起著重要調(diào)節(jié)作用，凋亡信號(hào)刺激導(dǎo)致線粒體膜通透性的改變或者蛋白復(fù)合孔的形成，使其從線粒體釋放至細(xì)胞胞漿，結(jié)合胞漿中的Apaf-1（apoptoticprotease activating factor-1）后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：Cyt C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase -3和其它下游caspase，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。免疫電鏡技術(shù)是免疫組織化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)的結(jié)合，研究抗原抗體在亞細(xì)胞定位的技術(shù)。研究通過免疫電鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在棕櫚酸的作用下，INS-l細(xì)胞線粒體嵴斷裂，空泡樣變，Cyt C從線粒體轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞胞漿，從而啟動(dòng)一系列caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使INS-1細(xì)胞凋亡增加，而各劑量甜茶素組線粒體膜較完整，嵴基本完好，大部分Cyt C蛋白還是結(jié)合在線粒體上，沒有觀察到凋亡小體，其中以甜茶素50μmol/L組的保護(hù)作用最好。因此，研究認(rèn)為甜茶素對(duì)INS-1細(xì)胞具有抗氧化保護(hù)作用，其機(jī)制可能為阻礙Cyt C從線粒體釋放入細(xì)胞胞漿，阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，減少細(xì)胞的凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運(yùn)糖基化修飾以及Ca²⁺的儲(chǔ)存與分布的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與類同醇激素的合成和糖類和脂類的代謝等。細(xì)胞在脂毒性產(chǎn)生的多種氧自由基和凋亡因子的刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集以及Ca2代謝紊亂而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的破壞，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，F(xiàn)RS）。研究發(fā)現(xiàn)，ERS在介導(dǎo)細(xì)胞損傷及凋亡中起重要作用，并可能與肥胖胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸模型組INS-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，核糖體脫落，可見細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生了嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，未折疊蛋白增多、Ca2超載，激活鈣調(diào)蛋白calpain從而激活下游的caspase，引起INS-1細(xì)胞凋亡。在甜茶素各劑量組，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張的現(xiàn)象得到了改善，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)類似于正常的INS-l細(xì)胞，表明甜茶素可以逆轉(zhuǎn)高脂狀態(tài)對(duì)這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，拮抗棕櫚酸的氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，研究以棕櫚酸作用于體外培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血脂代謝障礙產(chǎn)生的內(nèi)環(huán)境改變，并應(yīng)用甜茶素進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)甜茶素對(duì)棕櫚酸干預(yù)下的胰島細(xì)胞瘤INS-l細(xì)胞具有保護(hù)作用，最佳保護(hù)濃度為50μmol/L。其保護(hù)機(jī)制可能為阻礙Cyt C從線粒體轉(zhuǎn)位入細(xì)胞胞漿，阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)脂毒性對(duì)INS-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)破壞嚴(yán)重，而各劑量組的甜茶素均能夠有效的保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)，這個(gè)過程中甜茶素是否逆轉(zhuǎn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所產(chǎn)生的凋亡信號(hào)，值得進(jìn)行下一步的研究。