王鶴++陳擁軍++張中華

【摘要】 目的：探討白術(shù)多糖對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的誘導(dǎo)作用。方法：采用不同濃度（30、60.120mg/ml）、不同時(shí)間（24、48h）白術(shù)多糖注射液處理SGC-7901細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Westernblot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，RTRCR檢測(cè)p53mRMA。結(jié)果：白術(shù)多糖注射液對(duì)SGC-7901細(xì)胞體外凋亡具有促進(jìn)作用，并呈現(xiàn)劑量及時(shí)間成正相關(guān)；白術(shù)多糖注射液處理后，SGC-7901細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)及Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值顯著升高，Bcl -2蛋白表達(dá)顯著降低，并呈現(xiàn)劑量及時(shí)間依賴性；SGC-7901細(xì)胞P53mRNA表達(dá)隨白術(shù)多糖濃度的增高而增強(qiáng)。結(jié)論：白術(shù)多糖促進(jìn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax、p53mRWA和下調(diào)Bc1-2表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 白術(shù)多糖SGC-7901；細(xì)胞凋亡；機(jī)制研究

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517（2015）24-0010-02

白術(shù)為我國常用中藥之一，為菊科植物白術(shù)（Atrac-tylodes macrocephala Koidz）的干燥根莖，其性溫，味甘苦，具有健脾益氣、燥濕利水的功效，臨床用于治療脾胃氣弱、瀉泄、汗出、胎動(dòng)不安等。藥理研究表明，多糖是中草藥發(fā)揮獨(dú)特療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，并發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。研究采用體外培養(yǎng)方法，觀察了不同濃度白術(shù)多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞株sGc-7901凋亡和對(duì)Bax、Bcl-2、P53mRNA表達(dá)的影響，為白術(shù)多糖抗胃癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細(xì)胞株SGC-7901（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤研究所）；白術(shù)多糖（陜西慈緣生物技術(shù)有限公司）；小牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液（Gibco公司）；MTT（Sigma公司）；Bcl-2、Bax單抗（Santa Cruz公司）；凋亡試劑碘化丙啶（ PI）和Annexin-V-FITC凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Trizol試劑（ invitrogen）；DSS（Sigma公司）；Taq酶（鼎國公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇胃癌細(xì)胞株scc-7901，按貼壁方法培養(yǎng)，用含有雙抗（每lOOml分別含青霉素1萬單位和鏈霉素lOmg）及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，然后用滅菌的5.6% NaHC03調(diào)pH值至7.2，置于37℃、5%C0₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48h用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/ml，將細(xì)胞加至96孔板，sooμL/孔，另設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。將細(xì)胞置于37℃、5%C0₂溫箱中培養(yǎng)12h后，加入終濃度為30、60、120mg/ml的白術(shù)多糖并在不同時(shí)間點(diǎn)（24、48h）對(duì)SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共4組。細(xì)胞置37℃、5%C0₂溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后1200r/min，離心4min，棄上清液，用流式細(xì)胞儀按照試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3

Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 30、60、120mg/ml白術(shù)多糖注射液處理細(xì)胞48h后，提取胞質(zhì)蛋白，按照Western blot操作步驟進(jìn)行Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.2.4

RT-PCR檢測(cè)p53mRNA 用Trizol提取總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（ RT）及多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。基因擴(kuò)增條件為：94℃變性1min，62℃退火1mm，72℃延伸1min；進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，最后54℃ lOmin結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察并拍照，用Flour Chem V2.O凝膠成像分析軟件分析不同組別DNA擴(kuò)增帶的灰度值，以灰度值（p53）/灰度值（β-actin）作為基因p53mRNA的半定量指標(biāo)。引物由上海生工公司合成，具體如下。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS196.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用X²檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞體外凋亡率的影響 實(shí)驗(yàn)中觀察到各組胃癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，胞體橢圓變形多發(fā)，同時(shí)可見細(xì)胞壞死碎片。從表2可知，在不同預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)，不同濃度白術(shù)多糖對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞體外凋亡具有促進(jìn)作用，且與作用時(shí)間和處理劑量呈現(xiàn)正相關(guān)性。白術(shù)多糖濃度越高則對(duì)SGC-7901凋亡促進(jìn)作用越明顯（P

2.2 白術(shù)多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響不同濃度白術(shù)多糖處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48h后，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，而Bax蛋白表達(dá)顯著升高，前者與白術(shù)多糖濃度呈負(fù)相關(guān)，后者與白術(shù)多糖濃度呈正相關(guān)，說明二者可能與白術(shù)多糖促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的凋亡機(jī)制相關(guān)，具體見表3。

2.3 白術(shù)多糖對(duì)SCC-7901細(xì)胞p53mRNA表達(dá)的影響由表4可知，隨著白術(shù)多糖濃度的增高，SCC-7901細(xì)胞p53mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，說明白術(shù)多糖對(duì)促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡與p53基因有關(guān)系。

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著重要的作用，對(duì)生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育起著重要的作用。細(xì)細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。一個(gè)嚴(yán)密完整的程序化死亡過程，需在基因表達(dá)的激活、特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)等調(diào)控下進(jìn)行的自性、有序性死亡，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制。

白術(shù)多糖是一種多效的天然活性物質(zhì)，具有明顯的免疫增強(qiáng)作用，白術(shù)多糖能顯著增加小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量，能提高大鼠外周血白細(xì)胞的含量及血清免疫球蛋白和補(bǔ)體水平，增加NBT陽性率和血清溶菌酶的含量，促進(jìn)外周血、脾臟T/B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，注射白術(shù)多糖后能明顯減小S180荷瘤小鼠和Lewis肺癌小鼠的瘤重和瘤體比，明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，說明其能降低瘤細(xì)胞的增殖率。實(shí)驗(yàn)中，白術(shù)多糖干預(yù)后，胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡率能明顯提高，還可促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)和Bcl-2蛋白表達(dá)的下調(diào)以及上調(diào)p53mRNA的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡基因，而Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，二者是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要組成部分。p53基因定位于人類染色體17p13.1，由11個(gè)外顯子組成，編碼393個(gè)氨基酸組成的53 000的核內(nèi)磷酸化蛋白，全長(zhǎng)約20kb。其參與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、凋亡等，其激活可加快腫瘤細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，白術(shù)多糖可能通過上調(diào)Bax、p53mRNA和下調(diào)Bcl-2表達(dá)促進(jìn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡，但其是否可以誘導(dǎo)其他基因，以及具體介導(dǎo)通路仍需深入研究和探討。