黃 芳 祝婧云 梁新麗

(1 張家港市中醫(yī)醫(yī)院，蘇州，215600； 2 南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，南昌，330004； 3 江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌，330004)

葛根藥材中化學(xué)成分HPLC指紋圖譜研究

黃 芳1祝婧云2梁新麗3

(1 張家港市中醫(yī)醫(yī)院，蘇州，215600； 2 南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，南昌，330004； 3 江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌，330004)

目的：探索研究建立葛根高效液相指紋圖譜的方法與條件，以更好地控制葛根質(zhì)量。方法：Agilent1260高效液相色譜儀；kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm，E63848，25 cm)色譜柱；流動(dòng)相：A-乙腈；B-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，探索研究了葛根藥材以及提取物指紋圖譜。結(jié)果：運(yùn)用梯度洗脫法得到的色譜圖各色譜峰分離較好，達(dá)到指紋圖譜要求，初步建立了葛根的指紋圖譜。結(jié)論：HPLC指紋圖譜法使用方法不同，所得到的圖譜結(jié)果也會(huì)有所不同，可根據(jù)最后所得到的理想指紋圖譜來(lái)斷定高效液相的最佳使用條件方法。

葛根藥材；HPLC；質(zhì)量

葛根(Luerariae Lobatae Radix)為豆科植物野葛(PuerarialobataWilld Ohwi)的干燥根，主產(chǎn)于湖南、河南、廣東、浙江等地，秋冬季采挖，趁鮮切成厚片或小塊，干燥[1]。其被收載于《中華人民共和國(guó)藥典》各版。葛根性涼，味甘、辛，解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽(yáng)止瀉，通經(jīng)活絡(luò)，解酒毒[1]。各版的藥典中規(guī)定葛根中的葛根素為該藥材質(zhì)量控制的重要成分，但是鑒于針對(duì)中藥材或中成藥的真正質(zhì)量和療效并不能因?yàn)槟骋粋€(gè)有效成分而得到完全保證，故而，目前使用指紋圖譜技術(shù)已然成為能夠被國(guó)際公認(rèn)的控制中藥和天然藥物質(zhì)量的最有效的手段[2-7]。結(jié)合各版藥典中葛根素為其控制的有效成分以及指紋圖譜在中藥和天然藥物質(zhì)量控制中的作用和地位來(lái)開展中藥材葛根中化學(xué)成分的指紋圖譜方法研究。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)葛極藥材指紋圖譜的研究中，大多葛根素成分與其他成分很難分開[8-9]。作者參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]，通過實(shí)驗(yàn)考察不同洗脫條件下的指紋圖譜中各成分的分離情況，來(lái)建立中藥材葛根高效液相指紋圖譜，以作為評(píng)價(jià)和控制中藥葛根原藥材內(nèi)在質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 色譜儀器為Agilent 1260高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器)，DAD檢測(cè)器；SHB-III循環(huán)式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 藥物及試劑 葛根素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢測(cè)所，批號(hào)為101765-200408)，乙腈為色譜純，水為雙蒸水,其他試劑均為分析純。用于指紋圖譜的10批藥材葛根飲片購(gòu)自精華制藥亳州康普有限公司(產(chǎn)地安徽霍山縣葛根基地)。10樣品批號(hào)見表1。

表1 樣品批號(hào)

1.3 研究方法

1.3.1 梯度條件的優(yōu)化 色譜柱為kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm，25 cm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脫；考察乙腈起始濃度、終點(diǎn)濃度及梯度洗脫時(shí)間。流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL[13]。梯度洗脫考察見表2。色譜圖見圖1～圖4。結(jié)果表明0～40 min，乙腈濃度由10%～30%梯度洗脫，葛根提取液各色譜峰均能夠得到較好的分離，即表2中方法4。

1.3.2 對(duì)照品配制 精密稱取葛根素對(duì)照品適量，用甲醇稀釋成每1 mL含100 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取各批葛根飲片50 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加加10倍量雙蒸水加熱回流提取3 h，共提取3次，合并3次提取液，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

表2 梯度洗脫條件考察

1.3.4 指紋圖譜的建立

1.3.4.1 測(cè)定方法 分別精密量取葛根素對(duì)照品溶液和各供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按0～40 min，乙腈濃度由10%～30%，0.1%磷酸水由90%～70%梯度洗脫，記錄40 min色譜圖即得。對(duì)照品色譜圖見圖5，供試品色譜圖見圖4。以葛根素的色譜峰(s)的保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算其他各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值。

圖1 方法1葛根指紋圖譜

圖2 方法2葛根指紋圖譜

圖3 方法3葛根指紋圖譜

圖4 方法4葛根指紋圖譜

1.3.4.2 精密度試驗(yàn) 以葛根藥材A(批號(hào)20141104)為供試品，精密吸取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得共有峰11個(gè)，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD均<5%，結(jié)果表明精密度良好。

1.3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取A號(hào)樣品6份，精密稱定，制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積的RSD均<5%，結(jié)果表明其重復(fù)性較好。

1.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取A號(hào)葛根供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12進(jìn)樣，測(cè)得共有峰相對(duì)峰面積的RSD均<5%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 10批樣品共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 10批樣品共有指紋峰相對(duì)峰面積

圖5 A葛根HPLC指紋圖譜 B葛根素對(duì)照品

2 指紋圖譜分析與評(píng)價(jià)

2.1 共有指紋峰的標(biāo)定 根據(jù)10批供試品溶液HPLC色譜提供的相關(guān)參數(shù)，比較各批樣品的色譜圖，其中共有峰11個(gè)(圖5)。其中5號(hào)峰為葛根素的色譜峰。

表5 10批樣品共有指紋峰峰面積

2.2 共有指紋峰面積比 共有峰的峰面積、相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積：5號(hào)峰為葛根素，是葛根中的主要有效成分，其峰面積占總峰面積的48.3%，比較穩(wěn)定，因此，可以以其作為參照峰。共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積見表3、表4、表5。由表3、表4可知10批樣品間各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<5%，相對(duì)峰面積峰1、2、4、9、10RSD>5%。表5結(jié)果表明，共有峰總面積上總峰面積的平均百分?jǐn)?shù)為92.87%，RSD為1.86%,符合批紋圖譜的有關(guān)規(guī)定。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的是乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫法，能夠使葛根中的大部分黃酮類化合物(即中藥材葛根的主要有效成分)得到較好的分離[14]，因此得到了較完整的HPLC色譜圖。本實(shí)驗(yàn)方法精密度和重現(xiàn)性都很好，因此可以用來(lái)研究葛根化學(xué)成分HPLC指紋圖譜法出峰時(shí)間以及出峰質(zhì)量，可以更好地鑒別野葛的各種品種的真?zhèn)魏透鞣N不同產(chǎn)地，不同類別葛根藥材的內(nèi)在質(zhì)量的優(yōu)劣。

從指紋圖譜看，方法1和方法2出峰時(shí)間快，但色譜圖中很多峰未能較好的分離。方法3出峰時(shí)間也較短，出峰質(zhì)量較之方法1和方法2有了提高，但方法3中葛根素峰與其他峰未較好的分離。方法4出峰質(zhì)量最好，很清晰，能夠?qū)⒏鱾€(gè)峰很好地分離，對(duì)于葛根質(zhì)量的控制有很大的保證。

本實(shí)驗(yàn)探討研究應(yīng)用不同的方法，來(lái)獲得中藥材的指紋圖譜，探究了更加簡(jiǎn)便、更加可靠，可以用于大力推廣的正確方法。為以后的實(shí)際運(yùn)用提供切實(shí)可靠易行的參考方法。

[1]康廷國(guó).中藥鑒定學(xué)[M].9版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2014,4(3):113，115.

[2]郭方遒.基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的指紋圖譜技術(shù)及其用于復(fù)雜分析體系的表征和分析[D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2004.

[3]李守信,展金祥,劉武占,等.基于指紋圖譜的金銀花物質(zhì)組純化工藝研究[J].中草藥,2015,46(1):55-60.

[4]鐘可,王文全,靳鳳云,等.知母的HPLC-ELSD指紋圖譜研究[J].中草藥,2016,47(15):2747-2750.

[5]李強(qiáng),杜思邈,張忠亮,等.中藥指紋圖譜技術(shù)進(jìn)展及未來(lái)發(fā)展方向展望[J].中草藥,2013,44(22):3095-3104.

[6]祝明,陳碧蓮,石上梅.中藥指紋圖譜技術(shù)在中國(guó)藥典2015年版一部中的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2016,33(5):611-614.

[7]陳林偉,秦昆明,徐雪松,等.中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的研究現(xiàn)狀及展望[J].中草藥,2014,45(21):3041-3047.

[8]曹瑞敏.中藥指紋圖譜及其在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥房,2004,15(10):635-636.

[9]張信青,蔣孟良,崔淑芬,等.淺談指紋圖譜在中藥飲片質(zhì)量控制中應(yīng)用的可行性[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2005,11(3):55-58.

[10]方起程,林茂,孫慶民,等.葛根黃酮的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1974(5):271.

[11]王春蘭,陳建民.梯度反相HPLC法測(cè)定葛根中5種異黃酮含量[J].藥物分析雜志,1995，15(supple):292.

[12]苗明三.現(xiàn)代實(shí)用中藥質(zhì)量控制技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:172.

[13]陳士林,陳四保,楊大堅(jiān),等.葛根高效液相指紋圖譜的研究[J].中草藥,2003,34(7):661-663.

[14]尤春雪,張振秋,李峰,等.HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)對(duì)葛根中8種成分的測(cè)定及指紋圖譜研究[J].中草藥,2013,44(5),616-621.

(2016-05-19收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Study on HPLC Fingerprint Analysis on Chemical Composition of Radix Puerariae

Huang Fang1, Zhu Jingyun2, Liang Xinli3

(1TraditionalChineseMedicineHospitalofZhangjiagang,Zhangjiagang215600,China; 2ThefourthAffiliatedHospitalofNanchanguniversity,Nanchang330004,China; 3KeyLaboratoryofModernPreparationofTCMofMinistryofEducation,JiangxiUniversityofTCM,Nanchang330004,China)

Objective:To study the method and condition for HPLC fingerprinting of Radix Puerariae, in order to better control the quality of herbal medicine. Methods:Agilent 1260 by high performance liquid chromatograph was applied and kromasil 100-5C18(4.6 mmx250 mm, E63848, 25 cm) chromatographic column was established. The mobile phase was A-acetonitrile and B-0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution and velocity was set as 1 mL/min with the column temperature for 30 ℃. The detection wavelength was 250 nm to explore and study Radix Puerariae extracts of medicinal herbs as well as fingerprints. Results:Separation in each chromatographic peak of obtained chromatogram by the above method was great, meeting the requirements to fingerprints. The fingerprint for Radix Puerariae was preliminary established. Conclusion:As different HPLC fingerprint methods are applied, the map results will vary. The optimal use and ideal conditions of high performance liquid chromatography method can be summarized based on the result of the best fingerprints.

Radix Puerariae; HPLC; Quality

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：81303237)——白芷促進(jìn)P-gp介導(dǎo)活性成分吸收的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)理研究

黃芳(1977.11—)，女，本科，主管中藥師，研究方向：藥劑學(xué)研究工作，E-mail:huangfang@126.com

祝婧云(1986.11—)，女，碩士，主管中藥師，研究方向：藥劑學(xué)研究工作，E-mail:paln7@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.069