崔云華 雷 菲 趙繼夢 吳煥淦 徐惠芬 吳人照 何金森余曙光 黃 艷 吳璐一 劉世敏 胡 玲 劉慧榮

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海,200030； 2 浙江省湖州市中醫(yī)院，湖州，313000； 3 浙江省中醫(yī)藥研究院，杭州，310007； 4 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203； 5 成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都，611137； 6 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥，230038)

艾灸對EAT大鼠甲狀腺功能及其IL-17、IL-23表達(dá)影響的研究

崔云華1雷 菲1趙繼夢1吳煥淦1徐惠芬2吳人照3何金森4余曙光5黃 艷1吳璐一4劉世敏4胡 玲6劉慧榮1

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海,200030； 2 浙江省湖州市中醫(yī)院，湖州，313000； 3 浙江省中醫(yī)藥研究院，杭州，310007； 4 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203； 5 成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都，611137； 6 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥，230038)

目的：觀察艾灸干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(EAT)大鼠的效應(yīng)，以及對炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-23及受體表達(dá)的影響，擬闡釋艾灸干預(yù)EAT的作用機(jī)制。方法：將SD大鼠隨機(jī)分成5組：正常組、模型組、優(yōu)甲樂組、隔附子餅灸組和溫和灸組。采用碘劑和豬甲狀腺球蛋白聯(lián)合免疫的方法建立EAT動物模型，艾灸和西藥各干預(yù)30 d。觀察甲狀腺組織形態(tài)學(xué)、血清抗甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)和抗甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、IL-17、IL-23和IL-23R的濃度；甲狀腺組織IL-17、IL-23和IL-23R mRNA表達(dá)。結(jié)果：隔附子餅灸、溫和灸和優(yōu)甲樂均能糾正EAT大鼠甲狀腺的組織病理學(xué)改變。與正常組比較，模型組大鼠血清FT3下降(P<0.01)，血清TSH、TGAb、TPOAb濃度升高(P<0.05)，血清IL-17、IL-23和IL-23R蛋白的濃度升高(P<0.05)；甲狀腺組織IL-17、IL-23和IL-23R mRNA的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。與模型組比較，優(yōu)甲樂組血清FT3升高(P<0.01)，TPOAb、IL-23R濃度降低(P<0.05)；隔附子餅灸組大鼠血清FT3升高(P<0.01)，血清TSH、TGAb、TPOAb、IL-17、IL-23和IL-23R濃度降低(P<0.05)，甲狀腺組織IL-17、IL-23和IL-23R mRNA表達(dá)下降(P<0.05)；溫和灸組大鼠血清TSH、TGAb、TPOAb、IL-17和IL-23濃度降低(P<0.05)；血清IL-17、IL-23的濃度，甲狀腺組織IL-17、IL-23、IL-23R mRNA的表達(dá)水平和血清中TGAb的濃度呈正相關(guān)關(guān)系；血清中IL-17、IL-23、IL-23R的濃度，甲狀腺組織中IL-17 mRNA的表達(dá)水平與血清中TPOAb的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：隔附子餅灸、溫和灸均能有效糾正EAT大鼠甲狀腺組織病理學(xué)的變化，改善EAT大鼠的甲狀腺功能，降低甲狀腺自身抗體水平，可能與調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子IL-17和IL-23的表達(dá)有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎；艾灸；白細(xì)胞介素-17；白細(xì)胞介素-23；機(jī)制

橋本甲狀腺炎(Hashimoto′s Thyroiditis，HT)是一種臨床上常見的自身免疫性甲狀腺疾病，其病理特征主要表現(xiàn)為甲狀腺腺體腫大，腺體內(nèi)出現(xiàn)大量的淋巴細(xì)胞，患者血清中甲狀腺自身抗體陽性[1]。臨床表現(xiàn)為青中年女性甲狀腺無痛性彌漫性腫大[2]。隨著病情的發(fā)展甲狀腺功能失常，與自身免疫性疾病相關(guān)，是癌變的危險(xiǎn)因素[3-5]。目前本病的治療主要是甲狀腺激素替代療法，甲狀腺腫大明顯的可手術(shù)治療[6]，但復(fù)發(fā)率高[7]。因此，探討治療HT的安全有效的方法成為目前研究工作的熱點(diǎn)。據(jù)其臨床表現(xiàn)當(dāng)屬“癭病”范疇，以脾腎陽虛型為主，治當(dāng)溫陽健脾、調(diào)補(bǔ)肝腎[8]?，F(xiàn)代研究證實(shí)艾灸可改善機(jī)體的免疫功能[9]，隔附子餅灸能有效改善HT患者的癥狀，調(diào)節(jié)患者血清中甲狀腺自身抗體的濃度，提高患者的生活質(zhì)量[10-15]。徐惠芬觀察隔藥餅灸加左旋甲狀腺素鈉對本病的療效，總有效率從單用藥物的75.86%提高到86.67%[16]。

本研究采用采用碘劑加抗原免疫聯(lián)合誘導(dǎo)的方法，建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(EAT)大鼠模型[17-18]，探討艾灸對炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-23、IL-23R表達(dá)的影響，對炎性細(xì)胞因子與甲狀腺自身抗體TGAb、TPOAb濃度的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 體重為(100±20)g的清潔級SD大鼠42只，性別為雌性。動物來源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境：12 h晝夜節(jié)律交替，室溫(20±2)℃，室內(nèi)濕度50%～70%。所有動物用標(biāo)準(zhǔn)飼料、清潔飲用水適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 豬甲狀腺球蛋白(PTg)、完全弗氏佐劑(CFA)；不完全弗氏佐劑(IFA)、碘化鈉均購自Sigma公司；左甲狀腺素鈉片(優(yōu)甲樂? Euthyrox?50 μg)，德國Merk KGaA生產(chǎn)；淡附子粉由上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所醫(yī)療門診部中藥房提供；大鼠專用線艾條購自河南南陽漢醫(yī)艾絨制品廠；FT3、FT4、TSH、TPO-Ab、TGAb、大鼠IL-17、IL-23、IL-23R、IL-6均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；低溫臺式高速離心機(jī)，Thermo；全自動組織脫水機(jī)，Leica；多功能酶標(biāo)儀(BioTek)NANODROP，Thermo；ABI ViiA 7 Real Time PCR System，Applied Biosystems。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 EAT動物模型建立[17-18]所有動物用標(biāo)準(zhǔn)飼料、清潔飲用水適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常大鼠(n=9)和造模大鼠(n=33)。將PTg用PBS按(2 mg/mL)的比例稀釋，取稀釋后的PTg與CFA或IFA等體積混合充分乳化。造模大鼠于實(shí)驗(yàn)第1天接受初次免疫：在大鼠兩后肢足墊部皮下多點(diǎn)注射經(jīng)CFA乳化的PTg100 μL/只。加強(qiáng)免疫：取PTg100 μg/只+IFA等體積乳化，分別于實(shí)驗(yàn)第14天、第21天、第28天在大鼠兩后肢足墊部、兩后肢內(nèi)側(cè)以及背部皮下多點(diǎn)注射。正常大鼠在造模大鼠免疫的同時(shí)也注射等量生理鹽水做對照。正常大鼠僅予以清潔飲用水喂養(yǎng)，造模大鼠給予高碘水(含碘化鈉500 mg/L)喂養(yǎng)，碘水現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。

1.3.2 干預(yù)方法 造模大鼠造模結(jié)束后，從正常大鼠、造模大鼠中各隨機(jī)選取1只，摘取甲狀腺組織并做病理切片，觀察甲狀腺組織形態(tài)學(xué)變化以確定造模是否成功。鑒定模型成功后，將造模大鼠隨機(jī)分為4組：模型組(n=8)、優(yōu)甲樂組(n=8)、隔附子餅灸組(n=8)以及溫和灸組(n=8)。見圖1～圖4。

優(yōu)甲樂組：用優(yōu)甲樂懸濁液(1 μg/2 mL)灌胃，每只2.25 μg/(kg·d)，1次/d，共治療30 d。

隔附子餅灸組：大鼠剃毛，暴露穴位處皮膚，固定于大鼠固定架上，采用隔附子餅灸。將附子切細(xì)研末，以黃酒調(diào)和做餅，厚約0.5 cm，直徑約1 cm，上置大約90 mg艾炷施灸，取2組穴位：1)大椎、命門；2)天突、關(guān)元，每日取1組穴位，每次每穴灸2壯，2組穴位交替輪流施灸，1次/d，共灸30 d。

溫和灸組：大鼠剃毛，暴露穴位處皮膚，固定于大鼠固定架上，采用大鼠專用線艾條(直徑0.4 cm，長12 cm)2 g，以距離穴位3～5 cm的距離溫和灸,取穴：1)大椎、命門；2)天突、關(guān)元2組穴位，每日取1組穴位，2組穴位交替輪流施灸，1次/d，共灸30 d。

正常組、模型組、隔附子餅灸組和溫和灸組大鼠在優(yōu)甲樂組大鼠灌胃的同時(shí)也給予等量的蒸餾水灌胃，正常組、模型組和優(yōu)甲樂組做與隔附子餅灸組同樣的抓取固定。

圖1 溫和灸大椎、命門穴 圖2 溫和灸天突、關(guān)元穴

圖3 隔附子餅灸大椎、 圖4 隔附子餅灸天突、

1.3.3 標(biāo)本的采集及觀察指標(biāo) 各組大鼠于治療結(jié)束后禁食不禁水12 h，予以2%戊巴比妥鈉(30～50 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離血清置于-20 ℃冰箱待測；分離甲狀腺，部分4%的福爾馬林固定，部分-80 ℃凍存待測。

HE染色觀察甲狀腺組織形態(tài)學(xué)變化；雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠血清中FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb、IL-17、IL-23和IL-23R的濃度；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測甲狀腺組織中IL-17A、IL-23和IL-23R mRNA的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察 HE染色后，光鏡下觀察觀察甲狀腺濾泡大小、濾泡上皮細(xì)胞的形態(tài)、濾泡上皮及濾泡間淋巴細(xì)胞的浸潤程度，進(jìn)行甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)改變分級和淋巴細(xì)胞浸潤強(qiáng)度分級分析。

2.1.1 甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)改變分級[19-20]分4級。0級：甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)正常；1級：甲狀腺濾泡出現(xiàn)灶性紊亂；2級：甲狀腺濾泡出現(xiàn)中等程度破壞；3級：甲狀腺濾泡出現(xiàn)彌漫性損害。

2.1.2 淋巴細(xì)胞浸潤強(qiáng)度分級 分4級。0級：沒有淋巴細(xì)胞浸潤；1級：有少量的淋巴細(xì)胞浸潤；2級：出現(xiàn)多部位小范圍的淋巴細(xì)胞浸潤；3級：出現(xiàn)彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤。甲狀腺病變程度=甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)改變程度+淋巴細(xì)胞浸潤程度。具體觀察結(jié)果如下。

圖5正常組(HE染色,×200)圖6模型組(HE染色,×200) 注:甲狀腺濾泡呈圓形或橢圓形,大小適中,濾泡上皮細(xì)胞呈低柱狀,濾泡腔內(nèi)充滿膠質(zhì),未見淋巴細(xì)胞浸潤。 注:大量濾泡破壞,大量淋巴細(xì)胞浸潤,間質(zhì)大量纖維組織增生。

圖7 優(yōu)甲樂組(HE染色,×200)圖8 隔附子餅灸組(HE染色,×200) 注:部分濾泡破壞,少量淋巴細(xì)胞浸潤,少量纖維組織增生。 注:少量濾泡破壞消失,間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞浸潤,少量纖維組織增生。

圖9 溫和灸組(HE染色，×200)

注：少量濾泡破壞，濾泡結(jié)構(gòu)不完整，少量淋巴細(xì)胞浸潤，少量纖維組織增生。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)各組大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)改變比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=23.316，P<0.01)，與正常組比較，模型組大鼠甲狀腺濾泡破壞比正常組嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，隔附子餅灸組、溫和灸組大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.01、0.04，P<0.05)。見表1。

各組大鼠淋巴細(xì)胞浸潤程度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=27.946，P<0.01)，與正常組比較，模型組的大鼠甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤程度比正常組嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，隔附子餅灸組、溫和灸組大鼠甲狀腺組織中淋巴細(xì)胞浸潤程度改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.02、0.04，P<0.05)。見表1。

表1 各組甲狀腺組織形態(tài)學(xué)比較

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 各組大鼠血清中FT3、FT4和TSH濃度的比較

各組大鼠血清中FT3的濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.819，P<0.01)。與正常組比較，模型組大鼠血清中的FT3濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，優(yōu)甲樂組、隔附子餅灸組大鼠血清中FT3濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。與優(yōu)甲樂組比較，隔附子餅灸組大鼠血清中FT3濃度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.167，P>0.05)。見圖10。

各組大鼠血清中FT4的濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.684，P=0.608，P>0.05)。見圖11。

各組大鼠血清中TSH的濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.018，P<0.01)。與正常組比較，模型組大鼠血清中TSH濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，優(yōu)甲樂組、隔附子餅灸組、溫和灸組大鼠血清中TSH濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。與優(yōu)甲樂組比較，隔附子餅灸組大鼠血清中TSH濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009，P<0.01)，溫和灸組大鼠血清中TSH濃度下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.423，P>0.05)。與隔附子餅灸組比較，溫和灸組大鼠TSH濃度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.06，P>0.05)。見圖12。

2.3 各組大鼠血清中TGAb和TPOAb濃度的比較

各組大鼠血清中TGAb的濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.533，P<0.01)。與正常組比較，模型組大鼠血清中TGAb濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019，P<0.05)。與模型組比較，優(yōu)甲樂組大鼠血清中TGAb濃度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.982，P>0.05)，隔附子餅灸組、溫和灸組大鼠血清中TGAb濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.017、0.025，P<0.05)。與隔附子餅灸組比較，溫和灸組大鼠血清中TGAb濃度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.993，P>0.05)。見圖13。

圖10 各組大鼠血清FT3水平比較圖11 各組大鼠血清FT4水平比較 注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01。NG:正常組;MG:模型組;CG:優(yōu)甲樂組;HPM:隔附子餅灸組;WMG:溫和灸組。 注:注:各組比較P均>0.05。NG:正常組;MG:模型組;CG:優(yōu)甲樂組;HPM:隔附子餅灸組;WMG:溫和灸組。

圖12 各組大鼠血清TSH水平比較

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；與優(yōu)甲樂組比較，▲P<0.01。NG：正常組；MG：模型組；CG：優(yōu)甲樂組；HPM：隔附子餅灸組；WMG：溫和灸組。

各組大鼠血清中TPOAb的濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.786，P<0.01)。與正常組比較，模型組大鼠血清中TPOAb濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，優(yōu)甲樂組、隔附子餅灸組、溫和灸組大鼠血清中TPOAb濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。與優(yōu)甲樂組比較，隔附子餅灸組大鼠血清中TPOAb濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033，P<0.05)，溫和灸組大鼠血清中TPOAb濃度下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.305，P>0.05)。與隔附子餅灸組比較，溫和灸組大鼠TPOAb濃度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.247，P>0.05)。見圖14。

圖13 各組大鼠血清TGAb水平比較圖14 各組大鼠血清TPOAb水平比較 注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。NG:正常組;MG:模型組;CG:優(yōu)甲樂組;HPM:隔附子餅灸組;WMG:溫和灸組。 注:與正常組比較,▲P<0.01;與模型組比較,■P<0.01;與優(yōu)甲樂組比較,▼P<0.05。

2.4 各組大鼠血清中IL-17、IL-23和IL-23R濃度的檢測結(jié)果 各組大鼠血清中IL-17濃度的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.178，P<0.01)。與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-17濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，隔附子餅灸組、溫和灸組大鼠血清中IL-17濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。與隔附子餅灸組比較，溫和灸組IL-17升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013，P<0.05)。見圖15。

各組大鼠血清中IL-23R濃度的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.301，P=0.006，P<0.01)。與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-23R濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，優(yōu)甲樂組、隔附子餅灸組大鼠血清中IL-23R濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.039、0.003，P<0.05)。與優(yōu)甲樂組比較，隔附子餅灸組大鼠血清中IL-23R濃度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.29，P>0.05)。見圖16。

各組大鼠血清中IL-23濃度的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=14.370，P=0.006，P<0.01)。與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-23濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，隔附子餅灸組、溫和灸大鼠血清中IL-23R濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.02、0.03，P<0.05)。與隔附子餅灸組比較，溫和灸組大鼠血清中IL-23濃度下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.98，P>0.05)。見圖17。

圖15 各組大鼠血清IL-17水平比較圖16 各組大鼠血清IL-23R水平比較 注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01;與隔附子餅灸比較,▲P<0.05。NG:正常組;MG:模型組;CG:優(yōu)甲樂組;HPM:隔附子餅灸組;WMG:溫和灸組。 注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,■P<0.05。NG:正常組;MG:模型組;CG:優(yōu)甲樂組;HPM:隔附子餅灸組;WMG:溫和灸組。

圖17 各組大鼠血清IL-23水平比較

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。NG：正常組；MG：模型組；CG：優(yōu)甲樂組；HPM：隔附子餅灸組；WMG：溫和灸組。

2.5 各組大鼠血清中IL-17、IL-23、IL-23R的濃度和血清自身抗體水平的相關(guān)性分析 對各組大鼠血清中IL-17、IL-23、IL-23R的濃度與其自身抗體水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17、IL-23的濃度均和TGAb、TPOAb水平存在正相關(guān)關(guān)系(r值分別為0.634、0.511、0.415、0.474，P均<0.05)。見圖18，圖19，圖20，圖21；IL-23R濃度和TPOAb水平存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.355，P=0.025)。見圖22。與TGAb水平存在正相關(guān)趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.112，P=0.493)。

2.6 各組大鼠甲狀腺組織中IL-17、IL-23和IL-23R mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果 各組大鼠甲狀腺組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=15.368，P=0.004，P<0.01)。與正常組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，隔附子餅灸組大鼠甲狀腺組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03，P<0.01)。見圖23。

圖18 血清中IL-17和 圖19 血清中IL-17和

圖20 血清IL-23和 圖21 血清IL-23和

圖22 血清IL-23R和TPOAb相關(guān)性

各組大鼠甲狀腺組織中IL-23R mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=12.684，P=0.013，P<0.05)。與正常組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中IL-23R mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01，P<0.05)。與模型組比較，隔附子餅灸組大鼠甲狀腺組織中IL-23R mRNA表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02，P<0.05)；優(yōu)甲樂組、溫和灸組大鼠甲狀腺組織中IL-23R mRNA表達(dá)水平下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.52、0.26，P>0.05)。見圖24。

與正常組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中IL-23 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013，P<0.05)。與模型組比較，隔附子餅灸組大鼠甲狀腺組織中IL-23 mRNA表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043，P<0.05)；優(yōu)甲樂組、溫和灸組大鼠甲狀腺組織中IL-23 mRNA表達(dá)水平下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.672、0.258，P>0.05)。見圖25。

圖23 各組大鼠甲狀腺組織中IL-17mRNA表達(dá)水平的比較圖24 各組大鼠甲狀腺組織中IL-23RmRNA表達(dá)水平的比較 注:與正常組比較,■P<0.01;與模型組比較,▲P<0.01。NG:正常組;MG:模型組;CG:優(yōu)甲樂組;HPM:隔附子餅灸組;WMG:溫和灸組。 注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。NG:正常組;MG:模型組;CG:優(yōu)甲樂組;HPM:隔附子餅灸組;WMG:溫和灸組。

圖25 各組大鼠甲狀腺組織中IL-23 mRNA

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。NG：正常組；MG：模型組；CG：優(yōu)甲樂組；HPM：隔附子餅灸組；WMG：溫和灸組。

圖26 甲狀腺中IL-17AmRNA和TGAb相關(guān)性(r=0.609,P<0.01)圖27 甲狀腺中IL-23R和TGAb相關(guān)性(r=0.44,P=0.015)

圖28 甲狀腺中IL-23RmRNA和TPOAb相關(guān)性(r=0.441,P=0.015)圖29 甲狀腺中IL-23mRNA和TGAb相關(guān)性(r=0.427,P=0.019)

2.7 各組大鼠甲狀腺組織中IL-17、IL-23和IL-23R mRNA表達(dá)水平與其自身抗體水平的相關(guān)性分析

隨機(jī)從每組的TGAb、TPOAb實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中選取6個(gè)數(shù)據(jù)與其甲狀腺組織中IL-17 mRNA、IL-23 mRNA和IL-23R mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，甲狀腺組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平與TGAb水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.609,P<0.01)。見圖26。與TPOAb水平存在正相關(guān)趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.355,P=0.054)；甲狀腺組織中IL-23 mRNA表達(dá)水平與TGAb水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.427,P=0.019)。見圖27。與TPOAb水平存在正相關(guān)趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.310,P=0.095)；甲狀腺中IL-23R mRNA與TGAb、TPOAb水平均存在正相關(guān)關(guān)系(r值分別為0.44、0.441，P值均為0.015)。見圖28，圖29。

3 討論

課題組前期及其他研究發(fā)現(xiàn)艾灸對HT有較好的療效。胡國勝、王曉燕等[21-23]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)艾灸治療后橋本甲狀腺功能減退的患者血清中總T3、T4的含量明顯升高，TSH的含量明顯降低；夏勇、張育瑛等[24-26]發(fā)現(xiàn)隔附子餅灸能夠改善HT患者甲狀腺功能，隔附子餅灸合優(yōu)甲樂組橋本患者TGAb、TPOAb下降率明顯；徐惠芬[16]發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸加左旋甲狀腺素鈉對本病總有效率從單用藥物的75.86%提高到86.67%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隔附子餅灸組能升高EAT大鼠血清過低的FT3水平，降低過高的TSH水平，溫和灸組也能降低TSH濃度，兩種灸法均能降低EAT大鼠血清中TGAb、TPOAP水平，且隔附子餅灸較優(yōu)甲樂更能降低TPOAb的濃度，提示隔附子餅灸和溫和灸均能改善甲狀腺功能，不同程度上降低甲狀腺自身抗體水平。TGAb、TPOAb是用來診斷HT的重要指標(biāo)[27]。HT患者體內(nèi)TGAb和TPOAb的陽性率分別為85%和95%[3]。但TGAb、TPOAb并不僅僅出現(xiàn)在甲狀腺疾病患者的體內(nèi)，RA[28]、SLE[29]、1型糖尿病[30]等自身免疫性疾病和內(nèi)分泌疾病患者內(nèi)體也內(nèi)出現(xiàn)TGAb和TPOAb的低度或中度升高。TGAb、TPOAb的產(chǎn)生與機(jī)體免疫功能紊亂密切相關(guān)，活化的Th可細(xì)胞誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌TGAb和TPOAb。而TGAb和TPOAb可通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用[31-32]或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用損傷甲狀腺細(xì)胞。TPOAb還可以通過與TPO的結(jié)合，抑制TPO的活性，使甲狀腺素合成減少，同時(shí)機(jī)體通過負(fù)反饋機(jī)制使TSH的分泌增加，從而導(dǎo)致甲減的發(fā)生。因此，降低HT體內(nèi)自身抗體的濃度有利于控制疾病的發(fā)展[25]。為了進(jìn)一步明確艾灸對本病的作用機(jī)制，本研究從免疫調(diào)節(jié)的角度采用EAT大鼠模型，探討艾灸對HT的作用機(jī)制。

隨著對HT發(fā)病機(jī)制研究的深入，Th1/Th2細(xì)胞并不能完全解釋HT的發(fā)病機(jī)制，炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-23和IL-23R也參與了HT的發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隔附子餅灸組、溫和灸組大鼠血清IL-17、IL-23濃度低于模型組，隔附子餅灸組血清IL-23R濃度也低于模型組，且隔附子餅灸組血清IL-17表達(dá)水平高于溫和灸組；隔附子餅灸組大鼠甲狀腺組織中IL-17 mRNA、IL-23R mRNA和IL-23 mRNA表達(dá)水平低于模型組。對血清IL-17、IL-23、IL-23R濃度、甲狀腺組織mRNA表達(dá)水平和血清自身抗體TGAb、TPOAb含量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清中IL-17、IL-23的濃度，甲狀腺組織中IL-17、IL-23、IL-23R mRNA的表達(dá)水平均和血清中TGAb的濃度呈正相關(guān)關(guān)系，血清中IL-17、IL-23、IL-23R的濃度，甲狀腺組織中IL-17 mRNA的表達(dá)水平均與血清中TPOAb的濃度也呈正相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)果提示艾灸可能通過降低IL-17、IL-23、IL-23R等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，減輕炎性反應(yīng)，起到保護(hù)甲狀腺的作用。Konca Degertekin C等[33]研究表明，甲狀腺功能正常以及功能減退的HT患者血清IL-17、IL-23水平與對照組比較明顯不同，甲狀腺功能正常HT患者血清IL-17、IL-23水平最高。Peng H[34]研究表明，HT患者外周血單核細(xì)胞IL-23R mRNA顯著增高，并且IL-23R mRNAs水平與血清TGAb水平呈正相關(guān)關(guān)系。Xue H等[35]研究表明，與健康對照組比較，HT患者血清IL-17表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Figueroa-Vega N等[36]研究表明，HT患者甲狀腺組織中IL-17、IL-23R(+)細(xì)胞表達(dá)增高，血清中IL-23表達(dá)增高。Li D等[37]發(fā)現(xiàn)HT患者血清IL-17水平顯著增高。吳漢妮等[38]研究表明，HT患者甲狀腺組織IL-23p19、IL-17蛋白以及IL-23p19、IL-17 mRNA的表達(dá)增高，并且IL-23p19 mRNA和IL-17mRNA的表達(dá)水平存在正相關(guān)，提示IL-23/IL-17可能參與了HT的發(fā)病過程。IL-23是IL-12家族中的一員，由P40和P19兩個(gè)亞單位組成，其中P40與IL-12共用，P19是IL-23獨(dú)特的亞單位，IL-23由因微生物刺激而活化的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[39-40]。IL-23能夠通過誘導(dǎo)STAT3的磷酸化[41]，起到促進(jìn)IL-17分泌的作用，是IL-17產(chǎn)生的一個(gè)關(guān)鍵的因素[41]。IL-23受體(IL-23R)只表達(dá)于活化的Th細(xì)胞或記憶T細(xì)胞，與IL-12Rβ1共同組成IL-23的受體復(fù)合物，通過與其配體IL-23結(jié)合發(fā)揮作用。

總之，基于臨床艾灸對HT有效，本研究首先明確艾灸對EAT大鼠保護(hù)效應(yīng)，接著探討了艾灸對EAT大鼠的免疫因子IL-17、IL-23及其受體的影響，發(fā)現(xiàn)隔附子餅灸能降低EAT大鼠血清及甲狀腺組織的IL-17、IL-23和IL-23R濃度及mRNA表達(dá)水平，糾正EAT大鼠甲狀腺組織病理學(xué)改變，改善EAT大鼠的甲狀腺功能。但該類炎性細(xì)胞因子的受什么調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)的具體途徑與疾病因果關(guān)系還需要進(jìn)一步深入研究。

[1]Wang S，Baidoo S E，Liu Y，et al.T cell-derived leptin contributes to increased frequency of T helper type 17 cells in female patients with Hashimoto′s thyroiditis[J].Clinical & Experimental Immunology，2013,171(1)：63-68.

[2]Akamizu T，Amino N，Degroot L J.Hashimoto′s Thyroiditis[M].South Dartmouth(MA)：MDText.com，Inc.; 2000-.：Available from：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/ NBK285557/.

[3]Xue H，Yang Y，Zhang Y，et al.Macrophage Migration Inhibitory Factor Interacting with Th17 Cells May Be Involved in the Pathogenesis of Autoimmune Damage in Hashimoto′s Thyroiditis[J].Mediators of Inflammation，2015,2015：1-9.

[4]Radetti G.Clinical aspects of Hashimoto′s thyroiditis[J].Endocr Dev,2014,26:158-170.

[5]Noureldine S I，Tufano R P.Association of Hashimoto′s thyroiditis and thyroid cancer[J].Curr Opin Oncol，2015,27(1)：21-25.

[6]Caturegli P，De Remigis A，Rose N R.Hashimoto thyroiditis：clinical and diagnostic criteria[J].Autoimmun Rev，2014,13(4/5)：391-397.

[7]李鳳紅，周靜.疏肝散結(jié)法治療橋本氏甲狀腺炎42例的臨床報(bào)告[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33(6)：53-55.

[8]高衛(wèi)衛(wèi)，姚昶.溫陽化痰法治療橋本氏甲狀腺炎60例臨床觀察[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31(1)：18-19.

[9]胡國勝，陳漢平，何金森，等.艾灸感應(yīng)傳導(dǎo)與循環(huán)免疫復(fù)合物含量變化的關(guān)系[J].上海針灸雜志，1987(3):1-2.

[10]夏勇，夏鳴喆，李藝，等.艾灸配合藥物改善橋本氏甲狀腺炎患者生活質(zhì)量的觀察[J].上海針灸雜志，2012，31(4)：219-221.

[11]夏勇，夏鳴喆，李藝，等.艾藥并用對橋本氏甲狀腺炎患者TPOAb和TGAb的調(diào)節(jié)[J].上海針灸雜志，2011，30(12)：807-809.

[12]張育瑛，夏勇，游世晶，等.艾藥結(jié)合治療84例橋本氏甲狀腺炎中醫(yī)證候分析[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,15(3)：95-96.

[13]張育瑛，夏鳴喆，李藝，等.隔附子餅灸對橋本氏甲狀腺炎血清特異抗體與甲狀腺功能的相關(guān)性分析[J].上海針灸雜志，2013,32(1)：25-27.

[14]夏勇，夏鳴喆，李藝，等.隔附子餅灸關(guān)元、命門為主對橋本甲狀腺炎患者甲狀腺功能的影響[J].中國針灸，2012，32(2)：123-126.

[15]Xia Y，Xia MZ，Li Y，et al.Clinical Study on Combined Moxibustion and Medication for Hashimoto′s Thyroiditis[J].J Acupunct Tuina Sci，2012，10(6)：359-363.

[16]徐惠芬.隔藥餅灸加左旋甲狀腺素鈉治療慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，23(6):459-461.

[17]Brazillet MP，Mignon-Godefroy K，Charreire J.Induction of experimental autoimmune thyroiditis(EAT)by heat-denaturated thyroglobulin(Tg)[J].Exp Clin Endocrinol Diabetes，1996，104(Suppl 3)：23-25.[18]姜玲，胡玲，黃慧鐘.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎動物模型的比較[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué),2010(3):7-9.

[19]Li M，Eastman C J，Boyages S C.Iodine induced lymphocytic thyroiditis in the BB/W rat：early and late immune phenomena[J].Autoimmunity，1993，14(3)：181-187.

[20]Allen E M，Appel M C，Braverman L E.The effect of iodide ingestion on the development of spontaneous lymphocytic thyroiditis in the diabetes-prone BB/W rat[J].Endocrinology，1986,118(5)：1977-1981.

[21]胡國勝，陳漢平，何金森.129.艾灸治療橋本氏甲狀腺炎的臨床研究[C].世界針灸學(xué)會聯(lián)合會成立暨世界針灸學(xué)術(shù)大會，1987.

[22]胡國勝，陳漢平，侯永建，等.隔藥灸治療橋本氏甲狀腺炎臨床觀察[J].中醫(yī)雜志,1992，33(5):30-32.

[23]王曉燕.隔藥餅灸治療慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎[J].中國針灸,2003，23(1):10-12.

[24]夏勇，夏鳴喆，劉世敏，等.隔附子餅灸關(guān)元、命門為主對橋本甲狀腺炎患者甲狀腺功能的影響[J].中國針灸,2012，32(2):123-126.

[25]夏勇，夏鳴喆，李藝，等.艾藥并用對橋本氏甲狀腺炎患者TPOAb和TGAb的調(diào)節(jié)[J].上海針灸雜志,2011，30(12):807-809.

[26]張育瑛，夏鳴喆，李藝，等.隔附子餅灸對橋本氏甲狀腺炎血清特異抗體與甲狀腺功能的相關(guān)性分析[J].上海針灸雜志,2013，32(1):25-27.

[27]Liu Y，Liu M，Zhang Y，et al.The expression of Fcgamma receptors in Hashimoto′s thyroiditis[J].Cell Immunol，2015，294(1)：33-38.

[28]Pan X F，Gu J Q，Shan Z Y.Increased risk of thyroid autoimmunity in rheumatoid arthritis：a systematic review and meta-analysis[J].Endocrine，2015，50(1)：79-86.

[29]Pan X F，Gu J Q，Shan Z Y.Patients with systemic lupus erythematosus have higher prevalence of thyroid autoantibodies：a systematic review and meta-analysis[J].PLoS One，2015，10(4)：e123291.

[30]Metwalley K A，El-Saied A R.Thyroid abnormalities in Egyptian children and adolescents with type 1 diabetes mellitus：A single center study from Upper Egypt[J].Indian J Endocrinol Metab，2014，18(5)：637-641.

[31]Zhang Y，Gao Y，Li M，et al.Avidity of thyroglobulin antibody in sera from patients with Hashimoto′s thyroiditis with different thyroid functional status[J].Clin Exp Immunol，2010，161(1)：65-70.

[32]Trbojevic B，Djurica S.Diagnosis of autoimmune thyroid disease[J].Srp Arh Celok Lek，2005,133(Suppl 1):25-33.

[33]Konca D C，Aktas Y B，Balos T F，et al.Circulating Th17 cytokine levels are altered in Hashimoto′s thyroiditis[J].Cytokine，2016，80：13-17.

[34]Peng H，Liu Y，Tian J，et al.Decreased expression of microRNA-125a-3p upregulates interleukin-23 receptor in patients with Hashimoto′s thyroiditis[J].Immunol Res，2015,62(2)：129-136.

[35]Xue H，Yu X，Ma L，et al.The possible role of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+)/CD4(+)IL-17A(+)cell imbalance in the autoimmunity of patients with Hashimoto thyroiditis[J].Endocrine，2015，50(3)：665-673.

[36]Figueroa-Vega N，Alfonso-Perez M，Benedicto I，et al.Increased circulating pro-inflammatory cytokines and Th17 lymphocytes in Hashimoto′s thyroiditis[J].J Clin Endocrinol Metab，2010，95(2)：953-962.

[37]Li D，Cai W，Gu R，et al.Th17 cell plays a role in the pathogenesis of Hashimoto′s thyroiditis in patients[J].Clin Immunol，2013，149(3)：411-420.

[38]吳漢妮，余玲，屈新才，等.IL-23、IL-17在橋本氏甲狀腺炎患者甲狀腺組織中的表達(dá)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2008,24(12):1182-1184.

[39]Zambrano-Zaragoza J F，Romo-Martinez E J，Duran-Avelar M J，et al.Th17 cells in autoimmune and infectious diseases[J].Int J Inflam，2014，2014：651503.

[40]Morrison P J，Ballantyne S J，Kullberg M C.Interleukin-23 and T helper 17-type responses in intestinal inflammation：from cytokines to T-cell plasticity[J].Immunology，2011，133(4)：397-408.

[41]Zambrano-Zaragoza J F，Romo-Martinez E J，Duran-Avelar M J，et al.Th17 cells in autoimmune and infectious diseases[J].Int J Inflam，2014，2014：651503.

(2016-12-07收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Effect of Moxibustion on Experimental Autoimmune Thyroiditis and Inflammatory Cytokines in Rats

Cui Yunhua1,Lei Fei1，Zhao Jimeng1，Wu Huangan1，Xu Huifen2，Wu Renzhao3，He Jinsen4, Yu Shuguang5,Huang Yan1，Wu Luyi4，Liu Shimin4，Hu Ling6，Liu Huirong1

(1ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMeridian,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China; 2HuzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,ZhejiangProvince,Huzhou313000,China; 3ZhejiangProvincialInstituteoftraditionalChineseMedicine,Hangzhou310007,China; 4ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 5ChengduUniversityofTCM,Chengdu611137,China; 6AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei230038,China)

Objective:To observe the effect of moxibustion on rats with experimental autoimmune thyroiditis (EAT), and to study the effect of moxibustion on the expression of IL-17, IL-23 and its receptor. Methods:Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups:the normal group, the model group, the euthyrox group, the aconite cake-separated moxibustion group and the mild moxibustion group. Model rats were immunized with porcine thyrogiobulin followed high iodine water to established animal models. The EAT model was identified after the last immunization. After 30 days′intervention of moxibustion and western medicine, the concentration of TGAb, TPOAb, IL-17, IL-23, IL-23R in serum, as well as the expression levels of L-17, IL-23, IL-23R mRNA in thyroid gland were detected. Results:All of the aconite cake-separated moxibustion, the mild moxibustion and the euthyrox could correct the histopathological changes of thyroid gland in EAT rats. Compared with the normal group, the levels of serum FT3 decreased (P<0.01), the concentration of serum TSH, TGAb and TPOAb increased (P<0.05), and the levels of IL-17, IL-23 and IL-23R mRNA expressionin in the thyroid tissue were increased in model group (P<0.05). Compared with the model group, the levels of serum FT3 increased (P<0.01), the concentration of serum TPOAb, IL-23 decreased in euthyrox group (P<0.05); and the levels of serum FT3 increased (P<0.01), the concentration of serum TSH, TGAb, TPOAb, IL-17, IL-23, IL-23R decreased (P<0.05), and the levels of IL-17, IL-23 and IL-23R mRNA expression in the thyroid tissue increased in aconite cake-separated moxibustion group (P<0.05); the concentration of serum TSH, TGAb, TPOAb, IL-17, IL-23 decreased (P<0.05), the concentration of serum IL-17, IL-23 and the levels of IL-17, IL-23 and IL-23R mRNA expression in the thyroid tissue were positively correlated with serum TGAb, the concentration of serum IL-17, IL-23, IL-23R and the IL-23R mRNA expression in the thyroid tissue were positively correlated with serum TPOAb in mild moxibustion group. Conclusion:Aconite cake-separated moxibustion and mild moxibustion can effectively correct the pathological changes of thyroid tissue in EAT rats, improve the thyroid function of EAT rats and reduce the thyroid autoantibody level, which may be related to the regulation of inflammatory cytokines IL-17 and IL-23 Expression.

Experimental autoimmune thyroiditis; Moxibustion; Interleukin-17; Interleukin-23; Mechanism

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(”973”計(jì)劃)項(xiàng)目(編號：2009CB522900；2015CB554501)；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(編號：2016LQ013)

崔云華、雷菲、趙繼夢為并列第一作者

吳煥淦(1956—)，男，博士，上海中醫(yī)藥大學(xué)首席教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：針灸作用的基本原理與應(yīng)用規(guī)律研究

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.011