黃 艷 顧沐恩 翁志軍 張建斌 施 茵 馬 喆竇傳字 劉慧榮, 吳煥淦, 王曉梅 李 璟

(1 上海中醫(yī)藥大學上海市針灸經(jīng)絡研究所，上海，200030； 2 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海，200437； 3 南京中醫(yī)藥大學，南京，210023)

逆灸“天樞”穴干預大鼠結(jié)腸組織基因表達譜的實驗研究

黃 艷1顧沐恩2翁志軍1張建斌3施 茵1馬 喆1竇傳字1劉慧榮1,2吳煥淦1,2王曉梅1李 璟2

(1 上海中醫(yī)藥大學上海市針灸經(jīng)絡研究所，上海，200030； 2 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海，200437； 3 南京中醫(yī)藥大學，南京，210023)

目的：探討逆灸“天樞”穴干預對健康大鼠結(jié)腸組織基因表達譜的影響，本文首次從轉(zhuǎn)錄組學的角度探討逆灸的作用機制。方法：16只成年的雄性SD大鼠隨機分成2組，正常組(NC)、正常+隔藥灸組(NM)，采用隔藥灸天樞穴(雙側(cè))7 d，在2%戊巴比妥鈉麻醉下獲取結(jié)腸組織。從大鼠的一般狀況、體重、結(jié)腸組織病理學，觀察隔藥灸天樞穴對健康的正常大鼠的效應。每組各取3只提取總RNA，采用RNA-seq的高通量測序的方法檢測結(jié)合生物信息學，分析結(jié)腸組織的mRNA表達譜。結(jié)果：與NC組比較，隔藥灸不導致的健康大鼠體重降低，不影響結(jié)腸組織病理學形態(tài)觀察。與NC組比較，NM組的結(jié)腸組織差異表達基因有866個，其中上調(diào)604個，下調(diào)262個。差異表達基因涉及的基因本體(GO)主要與細胞周期、免疫分子和蛋白質(zhì)生物過程相關(guān)，基因通路(Pathway)主要與機體免疫和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)。結(jié)論：艾灸“天樞”穴不損傷健康成年大鼠的結(jié)腸組織的形態(tài)，或能通過影響結(jié)腸組織的差異表達基因的生物學過程及通路，調(diào)節(jié)機體免疫功能而發(fā)揮艾灸保健與養(yǎng)生的作用。

逆灸；結(jié)腸組織；基因表達譜；炎癥性腸??；免疫

炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一種慢性非特異性腸道炎性反應性疾病，包括克羅恩病(Crohn′s Disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)，因慢性炎性反應不易治愈，易復發(fā)，影響機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，一直是消化道疾病中亟待解決的問題[1]。腸道黏膜感染和正常的吸收和傳輸障礙，使IBD患者的胃腸傳輸與健康人不同[2]。結(jié)腸是IBD的好發(fā)部位，伴有腸道的慢性炎性反應及微生物紊亂[3]。由于IBD發(fā)病機制尚未完全闡明，迄今為止，IBD在臨床上主要采取藥物控制和手術(shù)為主的治療方法，尚缺乏有效的防治措施。

“逆灸”即用灸法保健防病，是針灸“治未病”的主要預處理方法之一。明·高武在《針灸聚英》里說:“無病而先針灸曰逆，逆，未至而迎之也?！敝嗅t(yī)古籍記載了大量關(guān)于“逆灸”防病保健的案例與方法，這種艾灸療法被現(xiàn)代醫(yī)家和百姓用以養(yǎng)生，既可預防疾病發(fā)生又可既病防變。艾灸激發(fā)經(jīng)絡之氣，扶助正氣，提高機體抵御各種致病因子和應變的能力，調(diào)節(jié)免疫功能[4]。筆者所在團隊前期研究表明，艾灸“天樞”穴可緩解炎癥性腸病，調(diào)節(jié)免疫炎性反應因子[5-8]。本實驗采用系統(tǒng)生物學研究方法——轉(zhuǎn)錄組學，以雄性SD成年健康大鼠為研究對象，觀察艾灸“天樞”穴對機體的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體重(180±20)g，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物使用許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)條件：清潔級，12 h晝夜節(jié)律交替(上午7點—下午7點照明)，室內(nèi)溫度(20±2)℃，室內(nèi)濕度50%～70%，適應性飼養(yǎng)1周后開始正式實驗。實驗嚴格按照美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物的使用指南執(zhí)行，實驗過程中對動物的處置遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 NanoDrop-2000(Wilmington，DE，USA)；TRIzol試劑(Life Technologies，Carlsbad，USA)；TapeStation 2200(Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，CA，USA)；Illumina TruSeqTM RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，CA，USA)；Illumina HiSeq 2000 sequencer(Illumina，San Diego，CA，USA)；TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina，San Diego，CA，USA)；RNase inhibitor(ThermoFisher Scientific，Rockford，IL，USA)；實驗用小艾條(蘄艾，湖北)。

1.3 艾灸干預 NM組：取天樞穴(雙)，穴位的定位參考《實驗針灸學，李忠仁》。藥餅由中藥粉(黃連、附子、肉桂、木香、紅花、丹參和當歸)結(jié)合黃酒混合攪拌成厚糊狀，采用模具做成直徑1 cm，厚0.45 cm的藥餅；采用模具做成直徑和高分別為0.6 cm的艾柱，重90 mg。采用固定器固定好大鼠，暴露天樞穴(雙)，提前1 d將天樞穴的鼠毛剔除，將做好的艾柱放在藥餅的上面，然后將藥餅放置天樞穴位上(雙)，點燃艾絨，每個穴位每次2個艾柱，每天上午艾灸1次，共干預7次。采用與NM組固定相同的方法NC組的大鼠固定，固定時間相同。

1.4 樣本采集 隔藥灸干預7 d后，所有大鼠在2%戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)麻醉下，在距離肛門1 cm處采集6～8 cm的遠端結(jié)腸，每個結(jié)腸分成2部分，一部分用4%多聚甲醛固定，另一部分剪碎后置于凍存管中，用液氮凍存1 h后保存在-80 ℃冰箱備用。

1.5 結(jié)腸的組織病理學觀察 將固定于多聚甲醛的24 h的結(jié)腸組織取出，清潔修片后脫水包埋，切成4 μm薄片，采用HE染色在光學顯微鏡下觀察結(jié)腸的組織病理學變化。

1.6 總RNA抽提、質(zhì)控及文庫構(gòu)建 每組取3只結(jié)腸組織采用Trizol的方法提取結(jié)腸組織的總RNA，采用Nanodrop2000檢測其純度和濃度，采用安捷倫2200檢測總RNA的完整性，將RIN值大于7的總RNA用于文庫構(gòu)建。每個樣本取3 μg總RNA建立小RNA文庫，根據(jù)Illumina TruSeqTM RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，CA)操作說明分別選取不同的index標簽建庫。建庫完成后利用安捷倫2200檢測文庫的質(zhì)量。

1.7 RNA-seq高通量測序和數(shù)據(jù)分析 本實驗采用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina)試劑在cBot上生成簇，接著在Hiseq2000測序平臺上運行單端測序程序。測序過程由Illumian提供的Data collection software進行控制，實時數(shù)據(jù)分析。與參考序列比對，采用DESeq進行分析，計算變化倍數(shù)和P值，設定Fold Change≥2為上調(diào)，≤0.5為下調(diào)，P值<0.05，并將表達低于0.01的數(shù)值過濾掉。

1.8 基因通路分析和GO分析 利用https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp分析了基因本體(Gene Ontology，GO)和基因通路(Pathway)的富集分析，P值<0.05為顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 隔藥灸“天樞”穴對大鼠體重及結(jié)腸組織形態(tài)的影響 大鼠一般情況比較，發(fā)現(xiàn)2組大鼠均毛色密集光澤，大便成形，無便血、腹瀉，行動活躍、反應靈敏。大鼠在隔藥灸“天樞”穴后從第1天到第7天，體重共增加了35 g，正常組增長了33 g。與NC組比較，NM組體重增長差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 不同時間點2組大鼠體重比較

注：NC，正常組；NM，正常+隔藥灸組。(每組n=8)。

采用光學顯微鏡進一步觀察HE染色后的結(jié)腸組織病理學微觀變化，NC組與NM組的腸黏膜及腺體結(jié)構(gòu)均完整，排列整齊規(guī)則，無充血、水腫及壞死，無漿細胞及中性粒細胞的浸潤。見圖2。

圖2 2組結(jié)腸組織病理學比較

注：代表性HE染色(HE，×200)。NC，正常組；NM，隔藥灸組。(每組n=8)。

以上通過對體重和組織病理學觀察，我們發(fā)現(xiàn)隔藥灸天樞穴對大鼠的體重及結(jié)腸的組織病理學形態(tài)無明顯影響。

2.2 隔藥灸“天樞”穴對大鼠結(jié)腸組織基因表達譜的影響 每組取3只大鼠的結(jié)腸組織總RNA采用RNA-seq測序，觀察隔藥灸“天樞”穴對大鼠結(jié)腸組織基因表達譜的影響。與NC組比較，NM組的結(jié)腸組織差異表達基因有866個，其中上調(diào)604個，下調(diào)262個。見圖3。

采用Cluster3.0和Tree view軟件對差異表達的mRNAs聚類分析、熱圖，直觀的比較每組樣本之間均一性和組間的差異。2組共6個樣本采用hierarchical的聚類方法，分別分析上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因，結(jié)果提示NC組和NM組各3個樣本的差異表達基因，均按組別聚類。見圖4、圖5；兩個熱圖中可見每組3個樣本的表達較為一致，2組之間有明顯的差異。見圖4、圖5，圖4為上調(diào)的差異表達基因的聚類分析、熱圖；圖5為下調(diào)的差異表達基因的聚類分析和熱圖。其中，差異表達基因的差異倍數(shù)大于10的基因有14個，Gbgt1(FC=62.11)、Klhl14(FC=35.63)、LOC102547612(FC=34.30)、LOC102552171(FC=17.72)、LOC102554698(FC=14.72)、Pnmt(FC=14.07)、LOC102548299(FC=13.71)、LOC103693435(FC=13.67)、Lgsn(FC=12.42)、LOC103694852(FC=11.66)、LOC102551762(FC=11.63)、Crtam(FC=11.60)、LOC102555917(FC=10.52)、LOC684998(FC=10.01)。差異表達基因的差異倍數(shù)小于0.01的基因有17個，Hist1h2aa、LOC100361543、LOC100362185、LOC102547455、LOC102552851、LOC102554579、LOC103691297、LOC103692050、LOC103693135、LOC103693516、LOC103693531、LOC103694465、LOC679565、LOC683573、Pabpc1l、Serpinb2、Slc25a21。其中Gbgt1上調(diào)了62.11倍，是變化最大的基因。

圖3 結(jié)腸組織差異表達基因的數(shù)目

2.3 隔藥灸“天樞”穴對大鼠結(jié)腸組織差異表達基因的GO和Pathway的影響 隔藥灸影響了NC大鼠結(jié)腸組織的mRNAs表達，GO分析結(jié)果提示，差異表達基因主要與MHC Ⅰ類蛋白復合物、MHC Ⅰb類蛋白復合物、細胞周期蛋白密切相關(guān)，其中上調(diào)的604個基因主要與MHC Ⅰ類蛋白復合物、MHC Ⅰb類蛋白復合物、細胞周期蛋白相關(guān)；下調(diào)的262個基因主要與細胞外的蛋白質(zhì)基質(zhì)、分泌顆粒相關(guān)。見圖6。Pathway分析提示，差異表達基因主要與免疫炎性反應、類固醇和吞噬小體的作用關(guān)系密切。上調(diào)基因相關(guān)的通路有22個，其中主要與TNF-α信號通路、NOD樣受體信號傳導途徑、抗原提呈、Toll樣受體信號傳導途徑、P53信號通路、合成類固醇、吞噬小體相關(guān)；下調(diào)基因相關(guān)通路有4條，其中主要與花生四烯酸代謝、蛋白質(zhì)的消化與吸收和黏著相關(guān)。見圖7。

圖4 上調(diào)差異表達基因的聚類分析和熱圖

注：與NC組比較，NM組基因表達上調(diào)；NC，正常組；NM，正常+隔藥灸組。(每組n=3)。

圖5 下調(diào)差異表達基因的聚類分析和熱圖

注：與NC組比較，NM組基因表達下調(diào)；NC，正常組；NM，正常+隔藥灸組。(每組n=3)。

圖6 2組差異表達基因的GO分析

圖7 2組差異表達基因的Pathway分析

3 討論

炎癥性腸病發(fā)病率較高，每年的IBD預防保健費用巨大[9]。目前研究結(jié)果表明，炎癥性腸病與機體內(nèi)環(huán)境——腸道微生物群的異常免疫應答密切相關(guān)，樹突狀細胞存在調(diào)節(jié)Th1和Th17細胞介導免疫應答[10]。國外學者Joos觀察到針灸對CD和UC均有較好的療效[11-12]；針灸具有抗炎調(diào)節(jié)免疫的作用已被證實[13]；研究者所在團隊前期開展了隔藥灸對CD和UC的臨床和實驗研究，觀察到艾灸對IBD的良好效應，該效應可能與調(diào)節(jié)了結(jié)腸免疫炎性反應因子有關(guān)[14-17]?；谇捌谘芯康幕A，本研究采用RNA-seq高通量測序技術(shù)與方法，從轉(zhuǎn)錄組學的角度，探討艾灸“天樞”穴是否影響健康大鼠結(jié)腸組織全基因組表達。

艾灸健康大鼠“天樞”穴對體重及結(jié)腸組織形態(tài)的均無明顯影響，從組織病理學觀察未見充血、水腫和炎性反應細胞浸潤，表明艾灸不引起對健康大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學改變。然艾灸具有逆灸的保健作用，其機制尚未闡明。本實驗從系統(tǒng)生物學轉(zhuǎn)錄組學的角度，觀察了艾灸對健康大鼠結(jié)腸組織的全基因組表達譜的影響。研究結(jié)果表明，艾灸能影響結(jié)腸組織的基因表達譜，既有上調(diào)也有基因下調(diào)的差異表達基因，總體上調(diào)基因數(shù)較下調(diào)的基因數(shù)多。采用GO和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因所涉及的主要與細胞周期、機體免疫功能和蛋白質(zhì)代謝等密切相關(guān)。炎性反應對機體感染和損傷的局部組織所呈現(xiàn)的反應，是十分常見而又重要的基本病理過程，相關(guān)的免疫因子在結(jié)腸的免疫調(diào)節(jié)扮演重要角色。艾灸調(diào)節(jié)了多條免疫相關(guān)的通路：TNF-α信號通路、NOD樣受體信號傳導途徑、抗原提呈、Toll樣受體信號傳導途徑等。目前研究證實，針灸具有調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮抑制炎性反應的作用[13]，同時艾灸不僅能抑制結(jié)腸炎[18-20]，也能調(diào)節(jié)正常大鼠的免疫功能相關(guān)的因子，或可防止腸道炎性反應。另外，隔藥灸調(diào)節(jié)了正常大鼠結(jié)腸組織P53信號通路，參與細胞周期、蛋白質(zhì)代謝，或可防止腸道的癌變[21]。

隔藥灸調(diào)節(jié)正常大鼠結(jié)腸組織全基因組表達譜，影響多條免疫信號通路，或可調(diào)節(jié)機體的免疫功能，預防炎癥性腸病的發(fā)生。后續(xù)將進一步觀察逆灸“天樞”穴對炎癥性腸病的防治作用，以及逆灸“天樞”穴在病理狀態(tài)的影響的作用機制，以期為逆灸的臨床應用提供詳實的客觀依據(jù)。

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(2016-12-07收稿 責任編輯：洪志強)

Genome-wide Gene Expressions under the Effect of Preventative Moxibustion at ST25 in Rats

Huang Yan1，Gu Muen2，Weng Zhijun1,Zhang Jianbin3, Shi Yin1,Ma Zhe1, Dou Chuanzi1,Liu Huirong1,2,Wu Huangan1,2,Wang Xiaomei1, Li Jing2

(1ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMedian,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030，China; 2DepartmentofAcupuncture,YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China; 3NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023，China)

Objective:To investigate genome-wide gene expressions of preventative moxibustion at ST25 in healthy rats. Methods:A total of 16 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the normal group (NC) and the normal and herb-partitioned moxibustion group (NM). Starting from day 1, the NM group received herb-partitioned moxibustion at the Tianshu points (bilateral, ST25) for 7 days. On day 8, colon tissues were collected under anesthesia with 2% pentobarbital sodium. The effect of herb-partitioned moxibustion at the ST25 in rats was observed on the general conditions, body weights, and HE staining. Three samples from each group were selected for total RNA extraction. The gene expression profile in the colon tissues was analyzed by the RNA-seq combined with bioinformatics. Results:Compared with the NC group, herb-partitioned moxibustion did not take effect on weight and histopathological observation of the colon in healthy rats. The NM group had 866 differentially expressed genes in colon tissues compared to the NC group, of which 604 were up-regulated and 262 were down-regulated. KEGG pathway analysis indicated that these genes were involved in multiple pathways, including immunity and protein metabolism. Conclusion:Herb-partitioned moxibustion at ST25 alters genome-wide gene expressions in healthy rats, and affects the biological processes and pathways. The treatment can be used as a healthcare treatment against diseases.

Preventative moxibustion; Colon tissue; Gene expression profiling; Inflammatory bowel disease

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(”973”計劃)項目(編號：2009CB522900；2015CB554501)；國家自然科學基金青年項目(編號：81503659);中國博士后科學基金面上項目(編號：2015M570380)；上海市針灸機制與穴位功能重點實驗室資助(編號：14DZ2260500)；上海市重點學科資助項目(編號：S30304-A17)

王曉梅，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：針灸胃腸疾病的臨床與基礎；李璟，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，主要研究方向：針灸胃腸疾病的臨床與基礎研究

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.010