張登梅　年四季　葉迎春　楊　燕　于　紅　袁　青

(四川醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,瀘州646000)

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抗IL-13全人源單鏈抗體的篩選、可溶性表達及鑒定①

張登梅年四季葉迎春楊燕于紅袁青

(四川醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,瀘州646000)

[摘要]目的：篩選特異性好、有體外中和特性的抗IL-13單鏈抗體，并進行可溶性表達和鑒定。方法：前期課題組構建了大庫容量天然單鏈抗體文庫，本研究采用噬菌體展示技術對天然抗體文庫進行3輪富集，然后從3輪富集后的文庫中采用ELISA進行篩選抗IL-13 陽性單鏈抗體；將特異性好、親和力相對較高的陽性單鏈抗體轉入表達載體中進行表達并鑒定。結果：經(jīng)3輪噬菌體展示富集，有30%左右的克隆子為陽性；經(jīng)過約500株克隆子篩選，篩選到2株特異性和親和力相對較高，有體外中和特性的單鏈抗體；將篩選的單鏈抗體基因轉入表達載體LZ16 中進行了表達，并采用生物大分子相互作用技術、Western blot等進行了鑒定。結論：成功篩選到特異性好、親和力相對較高并具有體外中和活性的抗IL-13單鏈抗體。

白細胞介素在嗜酸性和非嗜酸性哮喘中扮演著重要的角色，其中白細胞介素-13(IL-13)是一個密切相關的細胞因子，它是由肥大細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和Th2細胞分泌，最重要的是Th2細胞分泌。IL-13是參與Th2細胞介導的氣道炎癥中一個關鍵性的細胞因子[1]，其誘導 B 細胞增殖和分化、促進 IgE 合成、活化嗜酸性粒細胞、延長嗜酸性粒細胞的存活、增加黏液分泌、引起氣道高反應(Airway hyperresponsiveness,AHR)和上皮細胞纖維化等，在哮喘的發(fā)生中起重要的作用[2，3]。IL-4/IL-13通過激活IL-4Rα，IL-13Rα1組成的異二聚體受體復合物，分享共同的受體機制和信號傳導通路，發(fā)揮不同的生物學作用[4]，尤其在Th2細胞介導的相關過敏性疾病如支氣管哮喘中發(fā)揮重要的作用。本研究欲從前期構建的天然全人源抗體文庫中篩選特異性好的抗IL-13單鏈抗體，為后期構建抗IL-4、IL-13雙特異性抗體奠定實驗基礎，為研制治療過敏性哮喘的抗體藥物奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料pET101、Ni-NTA 親和層析純化系統(tǒng)購自Invitrogen 公司；DNA標準分子量為TaKaRa 公司的1 000 bp； 蛋 白 Marker 為TaKaRa 公司的低分子量蛋白 Marker。pCANTAB-5E、大腸桿菌 TG1、輔助噬菌體 M13K07均購自 Gene 公司；抗 M13 HRP標記單克隆抗體購自 Amersham Biosciences公司；Anti-FLAG HRP 標記單克隆抗體購自sigma公司；IL-13Rα1購自sino biological公司。

1.2方法

1.2.1抗 IL-13全人源單鏈抗體的篩選 本研究前期構建了天然全人源scFv文庫，文庫容量達到了1.2×108，多樣性良好。以生物素化的人IL-13蛋白為抗原，采用噬菌體展示技術對全人源scFv文庫進行了3輪富集，隨機挑取3輪富集后的文庫克隆子進行噬菌體擴增，具體方法參見[5]，擴增后的噬菌體抗體用于ELISA 檢測。即包被液(50 mmol/L NaHCO3/Na2CO3，pH9.6) 稀釋人IL-13 蛋白至30 μg/ml，包被稀釋的抗原于酶標板內(nèi)4℃過夜，次日洗滌酶標板后，用封閉液37℃封閉1 h，加入擴增后的噬菌體抗體孵育，用二抗anti-M13-HRP標記單克隆抗體和底物TMB進行顯色(15~30 min)，在OD450讀數(shù)。

1.2.2篩選的單鏈抗體特性分析指紋圖譜分析：將ELISA陽性的單鏈抗體克隆子進行PCR擴增，采用BstN I酶切檢測篩選的陽性單鏈抗體序列的多樣性。

特異性：將篩選的OD450相對較高的單鏈抗體采用ELISA進行特異性分析。分別包被30 μg/ml人IL-13、人IL-4、人TSLP于酶標板上，封閉后加入噬菌體抗體孵育后，加入二抗anti-M13-HRP標記單克隆抗體和底物TMB進行顯色(15~30 min)，在OD450讀數(shù)。

競爭ELISA：篩選特異性較好的單鏈抗體進行競爭ELISA實驗，預測人IL-13受體(IL-13Rα1)和人IL-13、抗IL-13 scFvs和人IL-13結合是否為同一抗原表位，從而判斷抗IL-13 scFvs是否能封阻IL-13 與IL-13Rα1的結合。包被30 μg/ml IL-13 純化蛋白于酶標板內(nèi)4℃過夜，封閉液封閉酶標孔后，加入1∶1比例的噬菌體抗體和IL-13Rα1(分別用1、2 μg/ml)，用1∶1比例噬菌體抗體和PBS混合物作為對照，37℃濕溫孵育1 h后，洗滌后加入 HRP 標記抗 M13 單克隆抗體，37℃濕溫孵育 1 h，用TMB 顯色液顯色(15~30 min)，在OD450讀數(shù)。

1.2.3單鏈抗體基因中琥珀終止密碼子的校對對篩選的2個特異性和體外中和效果較好的陽性單鏈抗體進行測序，結果顯示在單鏈抗體第32位氨基酸處出現(xiàn)了琥珀終止密碼子。由于在E.coli TG1中，琥珀終止密碼子可以部分被抑制，所以在pCANTAB 5E載體體系中篩選的帶有琥珀終止密碼子的單鏈抗體會被通讀而表達，從而ELISA結果為陽性結果。將琥珀終止密碼子進行單點突變，終止密碼子突變?yōu)榘被酺rp (W)。

1.2.4單鏈抗體基因的可溶性表達本實驗室將PUC質(zhì)粒進行改進用于單鏈抗體表達，載體(LZ16)中引入了FLAG和His-tag標簽，表達于單鏈抗體的C端，便于單鏈抗體的純化和檢測。將琥珀終止密碼子校對后的單鏈抗體基因進行酶切后與LZ16連接，轉化到E.coli DH5αF′中。測序驗證插入基因正確后，于LBAG (LB培養(yǎng)基含100 μg/ml 氨芐青霉素和2%葡萄糖)37℃培養(yǎng)陽性轉化菌于OD600為0.6，離心后用LBA(LB培養(yǎng)基含100 μg/ml 氨芐青霉素)重懸沉淀，加入終濃度 1 mmol/L 的IPTG誘導表達5h，收集沉淀，超聲破碎細菌后，離心收集上清液用于單鏈抗體的純化和鑒定。

1.2.5單鏈抗體的鑒定Western blot:SDS-PAGE 電泳表達的單鏈抗體蛋白，電轉PVDF膜，封閉液封閉后，加入HRP標記抗FLAG抗體(1∶5 000稀釋)，化學發(fā)光法檢測表達的單鏈抗體蛋白。大分子相互作用技術：將人IL-13蛋白生物素化后固定于SA sensor上，加入純化的不同濃度的抗IL-13單鏈抗體，BLITZ儀器檢測抗原抗體的相互作用，計算抗IL-13單鏈抗體的親和力。

2結果

2.1抗 IL-13全人源單鏈抗體的篩選 以人IL-13蛋白為抗原，采用噬菌體展示技術將天然抗體文庫進行了3輪富集，隨機挑取經(jīng)3輪富集展示的單克隆子進行小量表達后，ELISA鑒定表達的單鏈抗體與人IL-13是否結合。結果顯示：30%左右的克隆子ELISA結果為陽性，可與人IL-13有良好的結合作用(圖1)。

2.2篩選的單鏈抗體特性分析將篩選的陽性單鏈抗體進行PCR擴增后，BstN I 酶切后顯示挑取的16個單克隆子中大部分單鏈抗體序列是不相同的，具有一定的多樣性(圖2)。將序列不相同的單鏈抗體進行小量表達后進行競爭ELISA，結果顯示有2株單鏈抗體可與IL13Rα1競爭性地與IL-13結合，說明單鏈抗體和IL-13、IL13Rα1和IL-13結合的抗原表位是相同的，表明篩選的2株單鏈抗體具有體外中和特性(圖3)。分析具有體外中和特性的2株單鏈抗體的特異性，結果這2株單鏈抗體顯示了良好的特異性(圖4)。

圖1　ELISA 檢測 經(jīng)三輪富集后文庫單鏈抗體與人IL-13的結合作用Fig.1　Test binding of IL-13 and scFvs from antibody library enriched for three rounds by ELISA

圖2　指紋圖譜分析篩選的陽性單鏈抗體序列的多樣性Fig.2　Analysis the diversity of sequence of positive scFvs by fingerprint

圖3　競爭ELISA 檢測抗IL-13 scFv、 IL-13 Rα1競爭性地與人IL-13的結合Fig.3　Detection of IL-13 scFv and IL-13 Rα1 competitive binding to human IL-13 by competitive ELISA

圖4　ELISA檢測抗IL-13單鏈抗體的特異性Fig.4　Detection of the specificity of scFvs against IL-13 by ELISANote：The proteins of human IL-13，IL4，TSLP were coated on the wells of ELISA plates and the scFv1，scFv2 against IL-13 were added.

2.3單鏈抗體基因的可溶性表達對特異性好，并

圖5　SDS-PAGE和Western blot檢測純化的scFv1和scFv2Fig.5　Detection of purified scFv1 and scFv2 by SDS-PAGE and Westrn blotNote: M.BenchMarkTMpre-stained protein ladder(Invitrogen);A.SDS-PAGE detection of purified scFv1 and scFv2;B.Westem blot detection of the expressed scFv1 and scFv2.

圖6　生物大分子相互作用技術(BLITZ)檢測scFv1 和scFv2的親和力Fig.6　Biomolecular interaction analysis (BLITZ) detection of the affinity of scFv1 and scFv2Note: A.scFv1; B. scFv2.

具有體外中和特性的2株單鏈抗體進行了序列測定，結果發(fā)現(xiàn)在第32位氨基酸處出現(xiàn)了琥珀終止密碼子，分析2株單鏈抗體序列，只有3個氨基酸位點不相同。在噬菌體展示技術對抗體文庫篩選的過程中，可能由于表達的外源基因對宿主的毒性作用，導致部分篩選的單鏈抗體發(fā)生突變而帶有琥珀終止密碼子，而在E.coli TG1中，琥珀終止密碼子可以部分被抑制，所以在pCANTAB 5E載體篩選體系中帶有琥珀終止密碼子的單鏈抗體會被通讀而表達，從而ELISA結果為陽性。

采用單點突變的方法將琥珀終止密碼子進行校正，校正后的氨基酸為W。將校正后單鏈抗體轉入表達載體LZ16中進行可溶性表達并對表達產(chǎn)物進行純化，結果顯示，在26 kD處出現(xiàn)了目的條帶(圖5A)。由于是將表達的細菌進行全菌超聲破碎，然后離心收集上清采用Ni-NTA親和樹脂進行純化，Ni-NTA 對細菌的一些蛋白可能會有非特異性結合，所以導致純化出現(xiàn)了非特異性的條帶。為了驗證在26 kD出現(xiàn)的條帶即為抗IL-13單鏈抗體條帶，采用Western blot 對表達的單鏈抗體進行了鑒定，由于表達載體上設計有His-tag和FLAG標簽，進行Western blot 時用的是anti-FLAG HRP標記的抗體，結果顯示，在26 kD處有單一條帶產(chǎn)生，說明表達純化的單鏈抗體正確(圖5B)。

2.4抗IL-13單鏈抗體親和力采用生物大分子相互作用技術(BLITZ)對表達純化的scFv1 和 scFv2進行了系列稀釋，與固定在SA sensor上的人IL-13蛋白相互作用，圖6顯示純化的單鏈抗體與人IL-13可良好的結合，由于這兩株單鏈抗體氨基酸序列只有3個不相同，計算其親和力，其親和力相差不大，scFv1 為6.073×10-7，scFv2 為2.267×10-7(圖6)。

3討論

IL-13是一種多效的Th2型細胞因子，通過刺激杯狀細胞分化、上皮細胞產(chǎn)生黏液，激活成纖維細胞，引起氣道高反應[6,7]。在哮喘的小鼠模型中，已經(jīng)證明 IL-13基因的過度表達會引起氣道炎癥、增加黏液分泌、上皮細胞纖維化、產(chǎn)生趨化因子[1]?？笽L-13單克隆抗體藥物已進入臨床試驗，但也只針對Th2細胞介導的氣道炎癥或血液嗜酸性粒細胞型哮喘有效[4,8-10]。有研究顯示：在局部過敏原刺激的鼻腔中，阻斷性抗IL-13單克隆抗體能夠抑制IL-13分泌，但沒有顯著減少嗜酸性粒細胞數(shù)或減輕鼻部癥狀[11]。通過深入研究IL-13在哮喘等過敏性炎癥疾病中的信號傳導通路，發(fā)現(xiàn)IL-13主要通過結合IL-13Rα1/IL-4Rα異二聚體發(fā)揮作用，IL-13Rα1/IL-4Rα能夠同時結合IL-13、IL-4進行信號傳導[12]。因此，能夠同時封阻IL-4與IL-13的信號通路，制備雙特異性全人源抗體為過敏性炎癥提供更好的療效。

從天然全人源抗體文庫中篩選出的單鏈抗體一般親和力比較低，通過本研究從前期構建的天然全人源抗體文庫中篩選出了2株特異性較好并具有體外中和特性的抗IL-13單鏈抗體，其親和力為10~7左右。后期將對其親和力進行進一步進化，為構建全人源抗IL-4、IL-13雙特異性抗體奠定實驗基礎。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-17]

(編輯許四平)

[關鍵詞]IL-13；全人源單鏈抗體；噬菌體展示

Selection,soluble expression and identification of full human scFvs against IL-13

ZHANGDeng-Mei,NIANSi-Ji,YEYing-Chun,YANGYan,YUHong,YUANQing.TheSchoolofBasicMedicalSciences,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000，China

[Abstract]Objective:To select specific and neutralizing scFv against IL-13 and soluble expression and identification them.Methods: In our previous study the scFv library were constructed,and here the scFv library was enriched and the positive scFv were screened from the enriched scFv library for three round.The specific positive scFvs with better affinity were ligated with expression vector for expression and identification.Results: After three rounds of enrichment,30% of clones were positive.The two specific scFvs with better affinity and neutralization were selected from almost 500 clones and then ligated with expression vector LZ16 for soluble expression.The expressed scFvs were identified by western blot and biomolecular interaction analysis.Conclusion: The specific scFvs against IL-13 with better affinity and neutralization had been selected successfully.

[Key words]IL-13;Human scFv;Phage display

通訊作者及指導教師：袁青(1978年-)，女，教授，主要從事重組抗體研究，E-mail:yuanqing_ok@hotmail.com。

作者簡介：張登梅(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事分子免疫學研究。

中圖分類號R392.11
①本文為四川省科技廳項目(2015JY0218,013SZZ005)和四川省教育廳項目(13ZB0262)。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)01-0065-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.014