李雅婧　諸葛福艷　梁娟　何金洋　譚寧　曾常春

摘要：目的：構(gòu)建一種高效轉(zhuǎn)染hCD4和hCCR5基因的慢病毒載體。方法：應(yīng)用Gateway技術(shù)構(gòu)建可表達(dá)hCD4和hCCR5的質(zhì)粒載體PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5，并進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，進(jìn)行慢病毒包裝，用qRT-PCR方法檢測(cè)293T細(xì)胞中hCD4/CCR5的mRNA表達(dá)。將本慢病毒載體轉(zhuǎn)染于小鼠白血病細(xì)胞L615，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hCD4/CCR5 mRNA的表達(dá)及對(duì)HIV-1的易感性。結(jié)果：成功構(gòu)建PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5質(zhì)粒表達(dá)載體，包裝成的慢病毒載體在293T細(xì)胞中具有hCD4/CCR5 mRNA水平的高表達(dá)（P<0.05）；轉(zhuǎn)染于L615細(xì)胞亦表現(xiàn)出hCD4/CCR5 mRNA水平的高表達(dá)（P<0.05），并具備了HIV-1入胞感染的特點(diǎn)。結(jié)論：成功建立hCD4和hCCR5基因雙啟動(dòng)的慢病毒載體，可使目的細(xì)胞高效表達(dá)hCD4及hCCR5分子，對(duì)HIV-1宿主細(xì)胞的制備、HIV/AIDS的發(fā)病機(jī)制和抗病毒研究具有積極的意義。

關(guān)鍵詞：慢病毒載體；hCD4/hCCR5；質(zhì)粒；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：R318 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-2409（2016）05-0006-06

慢病毒是一類逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猿免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）和貓免疫缺陷病毒（feline immunode ficiency virus，F(xiàn)IV）等。慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。作為一種體外基因運(yùn)輸?shù)墓ぞ?，與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒不但能感染分裂細(xì)胞，而且還能感染非分裂細(xì)胞，已發(fā)展為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因治療研究的重要工具。hCD4分子是一種膜分子，主要表達(dá)于輔助T（Th）細(xì)胞，也是HIV-1入侵細(xì)胞的主要受體。hCCR5作為G蛋白偶聯(lián)因子超家族（GPCR）成員的細(xì)胞膜蛋白，是細(xì)胞內(nèi)β趨化因子（RANTES、MIP-lα和MIP-1β）的受體，亦是HIV-1入侵機(jī)體細(xì)胞的主要輔助受體之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建hCD4/CCR5基因慢病毒載體，為新的HIV-1宿主細(xì)胞研制提供基本條件。

1材料與方法

1.1材料

GatewaySPCIonase^TMⅡEnzymeMix、GatewayLRClonaseTMⅡPlus Enzyme Mix購(gòu)自invitrogen公司，QIAquick Gel Extraction Kit購(gòu)自QIAGEN公司，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，PrimeSTAR^TMHSDNA Polymeras、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、GeneRuler^TM100 bp DNA Ladder購(gòu)自Takara公司，細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素/鏈霉素）、胰酶購(gòu)自GIBCO公司，包裝質(zhì)?；旌衔铮╒iraPower^TMPackaging Mix）由pHelper1.0、pHelper2.0、LV3/LV5 3個(gè)質(zhì)粒成比例混合而成，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒，轉(zhuǎn)染混合液：Opti-MEM I、Lipofeetamine 2000購(gòu)自invitrogen公司，RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.2制備方法

1.2.1利用PCR擴(kuò)增attBl-CD4-attB2反應(yīng)體系為5×Primer STARTM Buffer（Mg²⁺Plus）10μl，dNTPMixture（10μm）4μl，引物-F（10 μm）1μl，引物-R（10 μm）1μl，模板DNA 1μl，Primer STARTM HSDNA Polymerase 0.5μl，ddH20加至總體積50μl。擴(kuò)增程序：98℃3 min，98℃10 s，60℃10 s，72℃60 s共30個(gè)循環(huán)，72℃5 min；最后6×loading buffer終止反應(yīng)。用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，DNA瓊脂糖凝膠電泳回收參照QIAquick的瓊脂糖凝膠電-泳回收試劑盒，20℃冰箱保存。

1.2.2構(gòu)建pDown-CD4，pUP-Promoter、pTail-IRES/CCR5 25℃，BP反應(yīng)3 h（反應(yīng)體系為attB₁-CD4-attB₂100ng，pDonr221/pDonrP4P1r/pDonrP2rP3100ng，BP clonase 1μl，TE buffer up to 5μl）；加入蛋白酶K終止反應(yīng)（10 min，37℃）；轉(zhuǎn)化BP反應(yīng)產(chǎn)物到大腸桿菌Stb13；菌落PCR篩選陽(yáng)性克?。≒CR反應(yīng)體系：10×Taq Buffer with（NH₄）₂SO₄3μl，dNTP Mixture（10μm）3μl，MgCl₂2μl，引物-F（10μm）1.2μl，引物-R（10μl）1.2 μl，TaqDNApolymerase 1.5μl，模板DNA 2μl，ddH₂O 16.1μl，總體積為30μl。PCR擴(kuò)增程序：94℃3 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃1min共29個(gè)循環(huán)，72℃1 min；挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒；送交陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.3構(gòu)建重組病毒質(zhì)粒PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5小量提取質(zhì)粒pDown-CD4和骨架載體，25℃，LR反應(yīng)3 h；反應(yīng)體系為pUP-CMV12.89 ng，pDown-CD4 10.42 ng，pTail-IRES/CCR513.03 ng，骨架載體60.28 ng，LR clonase 1μl，TEbuffer up to 5μl；加入蛋白酶K終止反應(yīng)10 min；轉(zhuǎn)化LR反應(yīng)產(chǎn)物到Stbl3；菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆；挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒；送交陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.4基于293T細(xì)胞的慢病毒包裝 在5ml離心管先加入1-5 ml無(wú)血清Opti-MEMI培養(yǎng)液，再加入pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5、目的質(zhì)粒（各4μg），輕輕顛倒混勻；另取1支無(wú)菌的5 ml離心管，加入1.5ml無(wú)血清Opti-MEMI培養(yǎng)液和40μl的Lipofeetamine 2000，輕輕顛倒混勻。室溫孵育5min；將已稀釋DNA加入到含有Lipofeetamine 2000的無(wú)血清Opti-MEM I培養(yǎng)液中，輕輕顛倒混勻。室溫孵育20min，制備獲得DNA-Lipofeetamine 2000復(fù)合物。將復(fù)合物添加到293FT細(xì)胞中過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后24h，更換10 ml含10%血清DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后48 h、72 h收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮，分裝好的病毒放置80℃保存。

1.2.5 293T細(xì)胞中mRNA的qRT-PCR檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)50%左右，加入慢病毒載體，傳代培養(yǎng)。7 d后收集細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，參照潞蛻明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。引物序列為：CD4（上游引物：5-TGCCTCAGTATGCTGGCTCT-3，下游引物：5GAGACCTTrGCCTCCTTGTrC-3）；CCR5f上游引物：5-GCTGGTCATCCTCATCCTGATAA-3'，下游引物：5'-ATGGCCAGGTrGAGCAGGTA-3）和GAPDH（上游引物：5一TrCACCACCATGGAGAAGGC-3，下游引物：5-GGCATGGACTGTGGTCATGA-31。通過(guò)ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃1 min，94℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.2.6 L615細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)染及HIV-1感染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠白血病細(xì)胞L615，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)50%左右，加入慢病毒載體，傳代培養(yǎng)。3 d后收集細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，參照試劑說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA，以逆轉(zhuǎn)錄所得的eDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。7 d后，L615細(xì)胞感染HIV-1，收集2、4、6 h上清液提取RNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組之間的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1菌落PCR鑒定hCD4/CCR5

重組質(zhì)粒puro-CMV-CD4-IRES-CCR5菌落PCR鑒定結(jié)果如圖1所示，可見2個(gè)陽(yáng)性條帶，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，目的片段CD4和CCR5的理論大小約為193和75 bp，與其相符，表明CD4和CCR5皆為陽(yáng)性克隆?？蛰d體（Mock-Vector）Pgk-puro為空白對(duì)照。

2.2 PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5全序列

重組質(zhì)粒puro-CMV-CD4-IRES-CCR5載體的全序列測(cè)序結(jié)果見圖2，顯示所構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體均含有所設(shè)計(jì)的目的片段，其序列與設(shè)計(jì)的puro-CMV-CD4-IRES-CCR5核苷酸序列完全一致，證實(shí)目的片段已正確插入PLA.ExBi.P慢病毒載體，成功構(gòu)建了重組慢病毒載體。

2.3轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞CD4/CCR5基因在mRNA水平的表達(dá)

提取轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞中的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板進(jìn)行了qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示：與空的慢病毒載體（N-T）相比，CD4和CCR5mRNA水平的表達(dá)量顯著增加（P<0.05）。

2.4轉(zhuǎn)染L615細(xì)胞后的CD4/CCR5 mRNA表達(dá)及HIV-1感染檢測(cè)結(jié)果

L615細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒及進(jìn)行HIV-1感染的結(jié)果如圖4所示，圖A為L(zhǎng)615細(xì)胞感染慢病毒載體第3、5、7天后qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，其中T表示的是感染有表達(dá)hCD4/CCR5慢病毒的L615細(xì)胞，Control則是空載病毒對(duì)照，顯示轉(zhuǎn)染后3d、5d和7 d的hCD4和hCCR5的mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05）。圖B為轉(zhuǎn)染后L615細(xì)胞被HIV-1感染后上清中qRT-PCR第2、4、6 h檢測(cè)結(jié)果，其中T表示的是感染HIV-1的L615細(xì)胞，Control則是空載病毒對(duì)照組，顯示HIV-1RNA轉(zhuǎn)染后2、4、6 h表達(dá)顯著下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

CD4分子主要表達(dá)于輔助T（Th）細(xì)胞，是Th細(xì)胞TCR識(shí)別抗原的共受體（co-receptor），與MHCⅡ類分子的非多肽區(qū)結(jié)合，參與Th細(xì)胞TCR識(shí)別抗原的信號(hào)傳導(dǎo)。同時(shí)，CD4分子也是HIV的主要受體。CCR5是細(xì)胞內(nèi)β趨化因子[RANTES、（MIP-1）α/CCL3和（MIP-1）β/CCIA]的受體，具有調(diào)控T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的遷移、增殖與免疫的功能，主要表達(dá)于記憶性的靜止期T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞等的細(xì)胞膜上，目前研究亦表明CCR5是HIV-1侵入機(jī)體細(xì)胞的主要輔助受體之一。HIV-1對(duì)宿主細(xì)胞具有高度選擇性，僅能感染T4淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，受體的限制就是其基本原因之一。基于此，為使非HIV-1宿主細(xì)胞可被病毒感染，需克服受體的限制。

慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，它可以將外源的DNA插入到感染細(xì)胞的基因組中，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后比其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的致癌性低。與腺病毒載體相比，腺病毒載體攜帶的目的基因不能整合到宿主細(xì)胞的基因組中，在傳代的細(xì)胞中容易將基因信息丟失，同時(shí)一些腺病毒基因產(chǎn)物也會(huì)引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)選用了慢病毒進(jìn)行載體構(gòu)建，首先，加入了REV元件，因?yàn)樽罱难芯勘砻鞴羌苤泻蠷EV反應(yīng)元件（RRE）能提高外源基因的表達(dá)率，REV元件的存在能使基因組在插入載體時(shí)抑制異常連接；其次，將WPRE元件插入在慢病毒載體序列中，WPRE已被證明可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，加入WPRE元件后，在生產(chǎn)病毒顆粒時(shí)能夠增加病毒的滴度；第三，CMV作為CD4-IRES-CCR5的啟動(dòng)子和IRES雙啟動(dòng)子作用，CMV作為啟動(dòng)子不僅能使病毒的滴度提高，而且可以使基因的表達(dá)水平增加，能使其在不同類型的細(xì)胞中感染效率加強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Gateway技術(shù)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5，將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體進(jìn)行了Ndel/BamHI雙酶切鑒定和核苷酸測(cè)序分析，結(jié)果表明hCD4和hCCR5均正確地插入到了質(zhì)粒載體中。為了檢測(cè)慢病毒包裝后hCD4/CCR5的表達(dá)情況，采用qRT-PCR檢測(cè)了小鼠白血病細(xì)胞L615中hCD4和hCCR5基因在mRNA水平的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空的慢病毒載體相比，表達(dá)hCD4/CCR5分子的慢病毒載體的hCD4/CCR5基因在mRNA水平的表達(dá)量相當(dāng)高，這表明基于表達(dá)hCD4/CCR5分子的慢病毒載體是可以成功轉(zhuǎn)染鼠類細(xì)胞的。隨后，轉(zhuǎn)染后L615細(xì)胞進(jìn)行HIV-1感染，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，上清中HIVRNA表達(dá)量有顯著下降，這表明HIV-1病毒順利地入胞于小鼠白血病細(xì)胞L615中。也就是說(shuō)，應(yīng)用本研究所構(gòu)建慢病毒載體，轉(zhuǎn)染后L615細(xì)胞可成功表達(dá)hCD4及hCCR5分子，促成了鼠類細(xì)胞對(duì)HIV-1的入胞感染，作為一種構(gòu)建HIV跨物種細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)基因工具，對(duì)HIV/AIDS的發(fā)病機(jī)制、抗病毒研究具有積極的意義。