王英豪　陳志春　張理平　陳桂芬　宋澤杰

摘要：目的 優(yōu)選桑椹黃酮的提取工藝及其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制。方法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度為自變量，黃酮含量為響應(yīng)值，建立二次回歸方程，研究各因素對(duì)黃酮含量的影響，同時(shí)運(yùn)用多巴速率氧化法測(cè)定提取液對(duì)酪氨酸酶活性的影響。結(jié)果 通過(guò)二次回歸模型響應(yīng)面分析確定了超聲輔助提取桑椹黃酮的最佳條件：40%乙醇，料液比1∶30，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間50 min。在此條件下，黃酮含量為（19.16±0.23）mg/g，與理論預(yù)測(cè)值吻合，酪氨酸酶抑制率為（61.47±1.79）%。結(jié)論 由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的桑椹黃酮提取工藝方便可行，且具有較強(qiáng)的酪氨酸酶活性抑制作用。

關(guān)鍵詞：桑椹；黃酮；響應(yīng)面分析法；超聲提取法；酪氨酸酶

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.026

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）02-0093-05

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Flavonoids from Mori Fructus by Response Surface Methodology and Study on Anti-tyrosinase Activity WANG Ying-hao1， CHEN Zhi-chun2， ZHANG Li-ping1， CHEN Gui-fen1， SONG Ze-jie1 （1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China； 2. Pingshan Pharmaceutical Factory of Fuzhou， Fuzhou 350001， China）

Abstract： Objective To optimize the extraction technology of flavonoids from Mori Fructus and study its anti-tyrosinase activity. Methods Response surface methodology Box-Behnken center combination was adopted to design the experiment based on the results of the single-factor experiments. Ethanol concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic temperature and time were set as independent variables and flavonoid content was set as response value to establish a quadratic regression model. In addition， the effects of the extract on tyrosinase were investigated by using the rate of dopamine oxidation method. Results The optimum ultrasonic-assisted extraction technology was confirmed by response surface of quadratic regression model： ethanol concentration of 40%， solid-liquid ratio of 1：30， ultrasonic temperature of 60 ℃， and ultrasonic time of 50 min. Under these conditions， the actual contents of total flavonoids were （19.16±0.23）mg/g， which were in accordance with the theoretically predicted values. And its inhibition rate of tyrosinase activity was （61.47±1.79）%. Conclusion The extraction technology of flavonoids from Mori Fructus by response surface methodology is convenient and feasible， and has good effect of anti-tyrosinase activity.

Key words： Mori Fructus； flavonoids； response surface methodology； ultrasonic-assisted extraction technology； tyrosinase

酪氨酸酶是催化人體色素生成的限速酶，若人體的酪氨酸酶活性增強(qiáng)則會(huì)引起色素大量生成、沉淀，導(dǎo)致黃褐斑、老年斑等皮膚色素沉淀性疾病[1]。皮膚色素沉淀性疾病是皮膚科疑難病證，西醫(yī)采用維甲酸、曲酸等藥物治療，但存在一定不良反應(yīng)[2]。尋找有效抑制黑素生成的天然脫色劑是目前研究的熱點(diǎn)。

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金（2013J01377）

近十幾年來(lái)，從植物藥中找尋天然酪氨酸酶抑制劑引起廣泛關(guān)注，如白術(shù)、茯苓等[3-4]。桑椹為?？浦参锷orus alba L.的干燥果穗，味甘酸，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有滋陰補(bǔ)血、生津潤(rùn)燥功效。桑椹資源豐富，藥食兩用，含有豐富的黃酮類物質(zhì)及多種糖類、氨基酸、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)元素，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降糖、抗癌、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等作用[5-9]。目前響應(yīng)面法已被廣泛用于同時(shí)存在多因素影響的試驗(yàn)優(yōu)化[10-11]，其具有試驗(yàn)組合少、求得回歸方程精準(zhǔn)度高，且可同時(shí)研究幾種因素交互作用等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹總黃酮的超聲輔助提取工藝，并對(duì)其抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行初步研究，以期為桑椹的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與溶液配制

高效液相色譜儀（LC-20A，日本島津公司），十萬(wàn)分之一電子天平（DV215CD，美國(guó)奧豪斯公司），紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-9100，北京瑞利分析儀器公司），超聲微波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52，上海亞榮生化儀器廠），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，國(guó)華電器有限公司），低速離心機(jī)（TDL80-2B，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)10080-200707），槲皮素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)10080-200907），L-多巴（西安潤(rùn)澤生物技術(shù)有限公司，批號(hào)060108），蘑菇酪氨酸酶（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)CAS9002-10-2）。碳酸氫鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醇等均為分析純。桑椹藥材購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂門(mén)診部（產(chǎn)地福建省尤溪縣，批號(hào)20120915），經(jīng)王河山老師鑒定為桑科植物桑Morus alba L.的干燥果穗。

磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=6.8）：氫氧化鈉1.9 g，磷酸二氫鈉15.6 g溶于1 L雙蒸水中。酪氨酸酶：臨用前以PBS稀釋為1000 U/mL的溶液。L-多巴：以PBS稀釋為1.0 g/L的溶液。對(duì)照品溶液：分別精密稱取蘆丁對(duì)照品5.2 mg、槲皮素2.5 mg，分別置于25 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.208 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液和0.208 mg/mL槲皮素對(duì)照品溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]方法。分別精密吸取蘆丁對(duì)照品液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇至10 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液5.5 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后，以70%乙醇作為參比溶液，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度值（Y）和含量（X）進(jìn)行回歸，求得線性回歸方程Y=11.671X-0.003（r2=0.999 9），表明黃酮含量在0.104～1.664 mg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 提取工藝單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度 精密稱定干燥的桑椹粉末約3.0 g共5份，分別加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇60 mL，60 ℃超聲提取30 min，提取液濃縮定容至10 mL。精密移取濃縮液0.25 mL至25 mL容量瓶中，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，隨著乙醇濃度的增加，提取液中黃酮含量增加，在乙醇濃度為50%時(shí)達(dá)到峰值，此后出現(xiàn)較大幅度下降。此外，隨著乙醇濃度的增加，脂溶性提取物亦增加，會(huì)給后續(xù)純化帶來(lái)麻煩。綜合考慮，乙醇濃度以50%為宜。

2.2.2 料液比 精密稱定干燥的桑椹粉末約3.0 g共5份，分別加入50%乙醇30、45、60、75、90 mL，60 ℃下提取30 min。提取液濃縮定容至10 mL。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖2。可見(jiàn)，隨著料液比的增加，黃酮含量呈上升趨勢(shì)，且在1∶25時(shí)達(dá)到峰值，此后出現(xiàn)小幅度下降。雖然增加料液比能在一定程度上增加黃酮的提取量，但會(huì)增加生產(chǎn)成本且不利于后期濃縮工藝。綜合考慮，料液比以1∶25為宜。

2.2.3 超聲溫度 精密稱定干燥的桑椹粉末約3.0 g共5份，分別加入50%乙醇75 mL，分別在40、50、60、70、80 ℃提取30 min，提取液濃縮定容至10 mL。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)，隨著溫度的升高，黃酮的含量亦增加，但是高溫可能會(huì)導(dǎo)致一些活性成分失活，而且會(huì)增加雜質(zhì)的溶解度，同時(shí)隨著溫度升高，乙醇揮發(fā)更快，導(dǎo)致體積分?jǐn)?shù)下降。綜合考慮，超聲溫度以80 ℃為宜。

圖3 超聲溫度對(duì)黃酮含量的影響

2.2.4 超聲時(shí)間 精密稱定干燥的桑椹粉末約3.0 g共5份，分別加入50%乙醇75 mL，在80 ℃分別提取10、20、30、40、50 min，提取液濃縮定容至10 mL。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)，在10～30 min內(nèi)，黃酮含量迅速上升，但超過(guò)30 min后黃酮含量?jī)H小幅提升，故超聲時(shí)間以30 min為宜。

2.3 最佳工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn) 利用響應(yīng)面法中Box-Behnken中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定4個(gè)因素（自變量）的3個(gè)水平，以黃酮含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，采用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)桑椹黃酮的最佳工藝參數(shù)。因素水平及編碼見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得黃酮含量（Y）對(duì)乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、超聲時(shí)間（X3）、超聲溫度（X4）的二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=13.83-0.81X1+0.27X2+0.40X3+0.43X4-0.81X1X2+0.21X1X3+0.44X1X4-0.14X2X3+0.65X2X4-0.16X3X4-0.022X12+0.33X22+1.69X32+1.33X42。

方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映了各因素對(duì)指標(biāo)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向[13]。由此可知，影響桑椹黃酮含量的因素主次順序?yàn)椋阂掖紳舛?超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比。

2.3.2 方差分析 為了檢驗(yàn)得到的多元二次回歸模型的有效性，對(duì)該模型和模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，一次項(xiàng)乙醇濃度（X1）偏回歸系數(shù)較為顯著，二次項(xiàng)X32、X42偏回歸系數(shù)極顯著，其余變量的系數(shù)影響均不顯著，表明乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)桑椹黃酮含量影響較大。整體分析可知，模型P=0.027，表明選用的模型較為顯著；而失擬項(xiàng)P>0.05，表明該模型的擬合程度良好；決定系數(shù)R2=0.958 6，表明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性，響應(yīng)值的變化有95.86%與所選變量相關(guān)，試驗(yàn)結(jié)果具有較好的可靠性，可用該模型對(duì)桑椹黃酮含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，見(jiàn)表3。

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 通過(guò)對(duì)各因素的響應(yīng)面圖和等高線圖的分析，可以直觀地判斷各因素之間的交互作用程度及各單因素的變化趨勢(shì)。根據(jù)回歸分析結(jié)果所得響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖5。

當(dāng)超聲溫度和超聲時(shí)間為0水平時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，黃酮含量呈下降趨勢(shì)，黃酮含量最大值出現(xiàn)在低乙醇濃度（40%）與高料液比（1∶30）的交匯處。當(dāng)料液比和超聲時(shí)間為0水平時(shí)，黃酮含量隨著乙醇濃度的增加而下降，在超聲溫度達(dá)到70 ℃前，黃酮含量小幅上升，當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃后，黃酮含量顯著增加。同時(shí)，黃酮含量隨著超聲時(shí)間的增加顯著增加，最大值出現(xiàn)在低乙醇濃度（40%）與長(zhǎng)超聲時(shí)間（50 min）交匯處。

通過(guò)Design-Expert 8.0.5軟件優(yōu)化分析，獲得了模型預(yù)測(cè)的最佳條件及黃酮含量理論預(yù)測(cè)值，見(jiàn)表4?？紤]到實(shí)際操作的可行性，確定最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶30、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間50 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次測(cè)得黃酮含量分別為19.23、19.36、18.91 mg/g，平均值19.16 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值誤差僅為3.1%，且與課題組前期試驗(yàn)測(cè)定的傳統(tǒng)提取工藝中桑椹黃酮含量[（11.87±1.06）mg/g，n=3）]相比，含量顯著提高（P<0.01）。因此，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.4 酪氨酸酶活性抑制研究

參考文獻(xiàn)[12]方法。采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測(cè)，吸取L-多巴溶液（1.0 mg/mL）1.5 mL，加PBS（pH=6.8）1.0 mL，25 ℃溫浴10 min，然后加提取液（75 mg/mL）0.5 mL，同時(shí)加蘑菇酪氨酸酶（1000 U/mL）0.04 mL，在475 nm處測(cè)定樣品的吸光度（加入蘑菇酪氨酸酶后立刻計(jì)時(shí)，記錄5 min內(nèi)每分鐘末的吸光度值）。取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。用曲酸（0.1 mg/mL）代替提取物作為陽(yáng)性組，同法測(cè)定吸光度，取平均值，計(jì)算酪氨酸酶抑制率。酪氨酸酶活性抑制率（%）=[（A1-A2）-（A3-A4）]÷（A1-A2）×l00%。式中，A1為未加提取液的加酶混合液，A2為未加提取液和酶的混合液，A3為加提取液和酶的混合液，A4為加提取液而未加酶的混合液。

桑椹提取液和曲酸陽(yáng)性藥對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用見(jiàn)圖6。可知，桑椹提取液和曲酸對(duì)酪氨酸酶活性的抑制均在第2分鐘達(dá)峰值，最佳工藝條件桑椹提取液[黃酮含量（19.16±0.23）mg/g]的酪氨酸酶活性抑制率為（61.47±1.79）%，與陽(yáng)性藥曲酸的抑制率[（59.70±2.02）%]相當(dāng)，顯著高于傳統(tǒng)工藝桑椹提取液[黃酮含量（11.87±1.0 6）mg/g]的抑制率[（29.62±3.53）%]。提示桑椹對(duì)酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用，活性成分可能為黃酮類物質(zhì)。隨著黃酮含量的增加，抑制率亦顯著增加。

3 討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)桑椹黃酮超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：乙醇濃度40%、料液比1∶30、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間50 min。在此條件下，桑椹黃酮含量為（19.16±0.23）mg/g，與理論預(yù)測(cè)值19.77 mg/g誤差僅為3.1%，表明所得模型擬合程度高，準(zhǔn)確可靠，可用于桑椹黃酮超聲提取工藝的優(yōu)化篩選。

最佳工藝的桑椹提取液不僅黃酮含量顯著提高，且體外酪氨酸酶活性抑制作用亦顯著增加，其活性成分可能為黃酮類物質(zhì)。提示桑椹所含黃酮類物質(zhì)可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為天然的酪氨酸酶抑制劑，用于治療皮膚色素沉淀性疾病或制備美白保健品。

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（收稿日期：2015-04-26）

（修回日期：2015-05-17；編輯：陳靜）