李晨陽　高慧　陳燕　譚為　趙軍　徐芳

摘要：目的 建立新疆圓柏葉中蘆丁的含量測定方法，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法 采用高效液相色譜法測定。色譜條件：Phenomenex ODS-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃，檢測波長：266 nm。結(jié)果 蘆丁在0.022～0.88 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），加樣回收率為101.52%，RSD=1.67%（n=6）；樣品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論 該方法操作簡便，重復(fù)性好，可用于規(guī)范和控制新疆圓柏葉的藥材質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：新疆圓柏；蘆??；高效液相色譜法；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.025

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）02-0090-03

Content Determination of Rutin in Leaves of Juniperus Sabina L. LI Chen-yang1， GAO Hui2， CHEN Yan1， TAN Wei1， ZHAO Jun1， XU Fang1 （1. Key Laboratory of Uyghur Medicine， Xinjiang Institute of Materia Medica， Urumqi 830004， China； 2. Yili Institute for Food and Drug Control， Yining 835000， China）

Abstract： Objective To establish an HPLC method for content determination of rutin in leaves of Juniperus sabina L.； To provide references for its quality control. Methods The HPLC separation was performed on a Phenomenex ODS-A column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） in gradient elute mode with a mixture consisting of acetonitrile and 0.036 mol/L phosphate acid solution at 30 ℃； the flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was set at 266 nm. Results Rutin was in a good linear range with peak area within 0.022–0.88 μg （r=0.999 9）， and the average recovery of rutin was 101.52% （RSD=1.67%， n=6）. The properties of sample solution kept steady within 32 hours. Conclusion The method is simple and reproducible， and can be used for the quality standardization and control in leaves of Juniperus sabina L.

Key words： Juniperus sabina L.； rutin； HPLC； content determination

新疆圓柏Juniperus sabina L.，又名砂地柏、臭柏，為柏科圓柏屬常綠匍匐灌木，主要分布于新疆、內(nèi)蒙古、甘肅等地[1]。新疆圓柏葉在新疆民間常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、布氏桿菌病、皮膚瘙癢、小便不利、迎風(fēng)流淚、視物不清、頭痛等，收載于《維吾爾藥志》等醫(yī)藥文獻(xiàn)中[2]。黃酮類成分是柏科圓柏屬植物的主要特征性成分之一[3-5]。目前對新疆圓柏的研究主要集中在化學(xué)成分及人工種植技術(shù)上[6-8]。為開發(fā)這一植物資源，提高其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對不同產(chǎn)地新疆圓柏葉中的蘆丁進(jìn)行含量測定。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外可

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100080-200707，純度92.5%）；乙腈，色譜純（Fisher）；甲醇，色譜純（Fisher）；水，屈臣氏純凈水；磷酸等其他試劑為分析純。新疆圓柏葉于2014年6月在新疆烏魯木齊、伊犁、阿勒泰等地采集，由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為新疆圓柏Juniperus sabina L.的葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex ODS-A柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脫（0 min→20 min→25 min，乙腈14%→20%→14%）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：266 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗

蘆丁理論塔板數(shù)n=5.54（tR/Wh/2）2=19 658，說明在選定條件下，色譜柱的柱長、載體性能及色譜柱填充均符合要求，測定效果良好。蘆丁分離度R=2（tR2-tR1）÷（W1+W2）=2.53，符合2010年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定分離度應(yīng)大于1.5的要求。在上述色譜條件下，蘆丁的色譜峰與其他成分分離度良好。色譜圖見圖1。

2.3 供試品溶液的制備

取新疆圓柏葉，粉碎過40目篩，脫脂，取0.1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲提?。üβ?80 W，頻率25 kHz）30 min，放至室溫，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.22 mg的蘆丁對照品儲備溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取蘆丁對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取各對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=17 720 172.68X-8910.90，r=0.999 9，表明蘆丁在0.022～0.88 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 日內(nèi)及日間精密度試驗

取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次測定，測得蘆丁的RSD=0.83%；將上述藥材連續(xù)6 d在相同時間段取樣處理并測定，測得蘆丁RSD=2.32%。結(jié)果表明方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

準(zhǔn)確稱取同一樣品，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，并按上述色譜條件測定，測得蘆丁RSD=2.59%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、5、8、24、32 h進(jìn)樣測定，測得蘆丁RSD=1.05%，結(jié)果表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量樣品粉末6 份，每份約0.05 g，分別加入0.088 mg/mL蘆丁對照品溶液1.9 mL，再加入甲醇20 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液并測定，結(jié)果蘆丁平均回收率為101.52%，RSD=1.67%，見表1。

2.10 樣品含量測定

取13批新疆圓柏葉樣品粉末，約0.1 g，平行3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，測定蘆丁含量，結(jié)果見表2。

3 討論

新疆圓柏藥材中含有大量油脂類成分，這些成分的存在影響蘆丁含量測定，故測定前必須先對藥材進(jìn)行脫脂處理。供試品提取方法考察了不同提取溶劑、提取次數(shù)、提取時間及溶劑倍數(shù)對加熱回流法的影響，確定最佳提取方法為0.1 g藥材加入30 mL甲醇溶液，加熱回流2次，每次1.5 h，測得蘆丁含量為2.82 mg/g。同時考察了不同提取溶劑、提取時間及溶劑倍數(shù)對超聲提取的影響，確定最佳提取方法為0.1 g藥材加入20 mL甲醇，超聲0.5 h，測得蘆丁含量為3.29 mg/g。從樣品提取率及節(jié)約時間考慮，確定樣品制備方法為0.1 g藥材加入20 mL甲醇，超聲0.5 h。流動相選擇考察了甲醇-磷酸水溶液和乙腈-磷酸水溶液，結(jié)果表明，乙腈-磷酸水溶液對蘆丁的分離度和峰形更好，故采用乙腈-磷酸水溶液系統(tǒng)[9]。

本試驗采樣基數(shù)充足、范圍廣，涵蓋地產(chǎn)新疆圓柏多數(shù)產(chǎn)地。13批新疆圓柏葉中蘆丁含量差異較大，說明不同產(chǎn)地新疆圓柏葉的化學(xué)成分含量有差異，可能受氣候、環(huán)境、土壤和海拔等因素的影響。本研究結(jié)果可為新疆圓柏葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及其市場規(guī)范提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：維吾爾藥分冊[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：111.

[2] 劉勇民.維吾爾藥志：上冊[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：550-553.

[3] 趙軍，閆明，黃毅，等.新疆圓柏黃酮類成分的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2008，28（19）：33-37.

[4] 趙軍，閆明，黃毅，等.新疆圓柏化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志， 2008，32（12）：1461-1463.

[5] 田旭平，胡開峰，侯秀云，等.新疆圓柏葉揮發(fā)油化學(xué)成分變化的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2012，32（4）：123-127.

[6] 郭愛蓮，朱志誠，岳明.不同季節(jié)新疆圓柏總黃酮含量的變化[J].生物技術(shù)通訊，2006，17（3）：387-388.

[7] 許芳，趙軍，徐芳，等.新疆圓柏枝葉化學(xué)成分研究[J].中藥材，2013， 36（12）：1957-1959.

[8] 瑪依拉·買買提依明，滿爾哈巴·海如拉，于睿，等.新疆圓柏葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的探討[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（7）：1686-1687.

[9] 張文斌，趙汝海，程斌.HPLC法測定新疆圓柏葉中槲皮素的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2004，20（3）：223-224.

（收稿日期：2015-04-08）

（修回日期：2015-04-16；編輯：陳靜）