譚從娥　黃祥云

摘要：目的 建立右歸丸治療腎陽虛證療效相關(guān)的差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，探索右歸丸治療腎陽虛證的療效機(jī)制。方法 對前期實(shí)驗(yàn)取得的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)作進(jìn)一步數(shù)據(jù)挖掘。首先篩選腎陽虛證患者經(jīng)右歸丸治療前后比較的差異表達(dá)蛋白，再采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，定位網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，并以AmiGO數(shù)據(jù)庫對聯(lián)系緊密的蛋白質(zhì)作Gene Ontology（GO）條目富集。結(jié)果 篩選到7個差異表達(dá)蛋白質(zhì)（P<0.05）。這7個蛋白質(zhì)與另外10個預(yù)測蛋白質(zhì)構(gòu)成的差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)包含17個節(jié)點(diǎn)（蛋白質(zhì)）、57條邊（相互作用關(guān)系），其中22個蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的綜合置信值>0.7，其中C3、C5和CFH均為補(bǔ)體系統(tǒng)重要成分，其功能主要與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。結(jié)論 右歸丸對腎陽虛證的調(diào)控作用包括補(bǔ)體激活、創(chuàng)傷愈合、體液水平調(diào)節(jié)等多個方面，其中對補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用可能為右歸丸促進(jìn)腎陽虛證免疫平衡的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：腎陽虛證；右歸丸；蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.009

中圖分類號：R228；R2-05 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）02-0030-04

Analysis of Therapeutical Mechanism of Yougui Pills for Kidney-yang Deficiency Syndrome Based on Protein-protein Interaction Network TAN Cong-e， HUANG Xiang-yun （Shaanxi University of TCM， Xianyang 712046， China）

Abstract： Objective To develop a protein-protein interaction network related to therapeutic effects of Yougui Pills on kidney-yang deficiency syndrome； To explore the therapeutical mechanism of Yougui Pills for treating kidney-yang deficiency syndrome. Methods The proteome data obtained from previous experiments were applied again to do further data mining： first， differentially expressed serum proteins between kidney-yang deficiency patients in pre-treatment and post-treatment of Yougui Pills were screened； second， a protein-protein interaction network of differentially expressed proteins with STRING database was constructed. The key proteins in the network were positioned and their functions were enriched in gene ontology （GO） terms with AmiGO database. Results Seven serum proteins were found expressed differentially. These differentially expressed proteins were interacted with 10 predicted proteins. The constructed protein-protein interaction network consisted of 17 nodes （proteins） and 57 edges （interactions）. 22 edges reached high confidence of 0.7. The key network proteins of C3， C5 and CFH were important components of complement system， and their main functions were both involved in immune regulation. Conclusion Yougui Pills can regulate kidney-yang deficiency in many ways， including complement activation， wound healing， regulation of body fluid levels， etc. In these actions， the regulation on complement system may be one of the important mechanisms of Yougui Pills on kidney-yang deficiency syndrome.

Key words： kidney-yang deficiency； Yougui Pills； protein-protein interaction network

腎陽虛證臨床主要表現(xiàn)為腰膝酸軟、畏寒肢冷、夜尿頻多等，治法以溫補(bǔ)腎陽為主，臨床以右歸丸為

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81072731、81473559）；陜西省教育廳自然科學(xué)專項(xiàng)（2013JK0821）

代表方劑。右歸丸出自明代《景岳全書》，由熟地黃、炮附片、肉桂、山藥、山萸肉、菟絲子、鹿角膠、枸杞子、當(dāng)歸、杜仲組成，主要功效為溫補(bǔ)腎陽、填精益髓，主治腎陽虛證。我們前期采用核素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)，對經(jīng)右歸丸治療的4例腎陽虛證患者治療前后的蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒定，獲得了一批差異表達(dá)蛋白[1]。蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)不是孤立的，而是以蛋白質(zhì)之間的相互作用為基礎(chǔ)。右歸丸對腎陽虛證療效的發(fā)揮也是蛋白質(zhì)在一定時空下相互作用的結(jié)果。因此，必須在整體、動態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，才能對右歸丸療效的綜合性和復(fù)雜性有全面和深入的認(rèn)識。本研究采用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)建模方法，對前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，從蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系角度探索右歸丸治療腎陽虛證的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)來源于前期實(shí)驗(yàn)采用8通道iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測得到的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)[1]，對其中標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中8個通道均有定量信息的171個蛋白質(zhì)作進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

1.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選

分別計算各鑒定蛋白質(zhì)在治療前后表達(dá)量的平均值，采用配對t檢驗(yàn)比較治療前后差異，P<0.05認(rèn)為該蛋白質(zhì)的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用STRING（http：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫[2]構(gòu)建差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。STRING是用于搜尋已知蛋白質(zhì)和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)，其采用的預(yù)測方法有染色體臨近、基因融合、系統(tǒng)進(jìn)化譜和基于芯片數(shù)據(jù)的基因共表達(dá)等，系統(tǒng)利用打分機(jī)制對這些方法得出的結(jié)果給予一定權(quán)重，最終給出綜合得分。綜合得分越高，則蛋白質(zhì)間相互關(guān)系越緊密。采用AmiGO（http：//amigo.geneontology.org/rte）[3]對網(wǎng)絡(luò)中各蛋白質(zhì)模塊進(jìn)行Gene Ontology（GO）功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白質(zhì)篩選結(jié)果

與治療前比較，有7個蛋白質(zhì)的表達(dá)在治療后出現(xiàn)明顯差異（P<0.05），其中4個蛋白表達(dá)上調(diào)、3個蛋白表達(dá)下調(diào)，見表1。

2.2 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

7個差異表達(dá)蛋白質(zhì)和另外10個預(yù)測蛋白質(zhì)構(gòu)成了差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（見圖1）。該網(wǎng)絡(luò)包含17個節(jié)點(diǎn)（蛋白質(zhì)）、57條邊（相互作用關(guān)系），其中有22個邊的綜合置信值（confidence value）>0.7。

2.3 相互作用蛋白質(zhì)及其功能

將每個差異蛋白質(zhì)及其預(yù)測蛋白質(zhì)輸入AmiGO數(shù)據(jù)庫，分別從分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)過程3個方面對每個差異蛋白質(zhì)及其預(yù)測蛋白質(zhì)作功能顯著性分析，以P≤0.001為標(biāo)準(zhǔn)，獲得各差異蛋白質(zhì)及其預(yù)測蛋白質(zhì)顯著性GO類別，見表2。

3 討論

右歸丸為治療腎陽虛證的經(jīng)典方劑，其臨床療效已被證實(shí)，但其療效機(jī)制還僅得到部分闡釋[4]。我們前期在右歸丸治療前后對照的4例腎陽虛證患者中成功鑒定出了236個血清蛋白，并對篩選的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了初步的功能分析。然而，前期實(shí)驗(yàn)只是對單個差異蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行了分析，而對蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系未作研究。在生物學(xué)過程中，蛋白質(zhì)之間的相互作用是介導(dǎo)生物體整體變化的基礎(chǔ)，其生物學(xué)意義顯然遠(yuǎn)高于單個蛋白質(zhì)的變化[5]。從蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)出發(fā)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并從中預(yù)測出與功能密切相關(guān)的模塊，已成為研究復(fù)雜科學(xué)的一種手段。為了進(jìn)一步研究右歸丸對腎陽虛證干預(yù)效應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)化調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究對前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作進(jìn)一步的數(shù)據(jù)挖掘，重點(diǎn)分析差異蛋白質(zhì)的功能網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。要獲取蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，需借助生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)建模方法。目前，可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫有Osprey[6]、InterViewer[7]、Pajek[8]、STRING[2]等。STRING數(shù)據(jù)庫是一個搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)。這種作用既包括蛋白質(zhì)之間直接的物理的相互作用，也包括蛋白質(zhì)之間間接的功能相關(guān)性，具有操作簡單、可視化效果明顯的特點(diǎn)。

借助STRING網(wǎng)絡(luò)建模數(shù)據(jù)庫，我們構(gòu)建了7個差異表達(dá)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)中，7個差異表達(dá)蛋白和10個預(yù)測蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，共形成22對蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，說明右歸丸療效相關(guān)蛋白質(zhì)的作用并不是孤立的，而是相互聯(lián)系，彼此作用，共同發(fā)揮特定生物學(xué)功能。每個差異表達(dá)蛋白質(zhì)和其預(yù)測蛋白質(zhì)功能相似，構(gòu)成一個蛋白質(zhì)相互作用功能模塊，每個模塊都主導(dǎo)著其相應(yīng)的生物學(xué)過程，主要涉及補(bǔ)體激活、創(chuàng)傷愈合、體液水平調(diào)節(jié)、血液凝固等。其中C3、C5和CFH均為補(bǔ)體系統(tǒng)重要成分。C3是補(bǔ)體系統(tǒng)的中心成分，處在補(bǔ)體激活的3條途徑樞紐位置，它既參與天然防御，同時還可觸發(fā)適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)[9]。C5也是補(bǔ)體系統(tǒng)的一種重要組分，其裂解成分C5a對免疫應(yīng)答有明顯增強(qiáng)作用，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-l、IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子[10]等細(xì)胞因子，促進(jìn)抗原及同種異體抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖及B細(xì)胞產(chǎn)生抗體等。本研究結(jié)果顯示，腎陽虛證患者C3和C5經(jīng)右歸丸治療后均出現(xiàn)差異表達(dá)，而且與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中多個蛋白發(fā)生相互作用，并參與了多個功能的執(zhí)行，說明右歸丸對腎陽虛證的調(diào)控作用是多層次的，這和中醫(yī)理論強(qiáng)調(diào)的整體調(diào)節(jié)理念是一致的。本研究通過對網(wǎng)絡(luò)中重點(diǎn)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的功能挖掘，得到了一些右歸丸療效相關(guān)的核心調(diào)控蛋白，如免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的蛋白如C3、C5、CFH等，提示在右歸丸治療腎陽虛證的眾多療效機(jī)制中，補(bǔ)體系統(tǒng)成分可能為其促進(jìn)免疫平衡的分子基礎(chǔ)之一。

總之，本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選右歸丸治療腎陽虛證的差異表達(dá)蛋白，從蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系角度，構(gòu)建差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并分析網(wǎng)絡(luò)中蛋白模塊的功能，從宏觀角度分析右歸丸對腎陽虛證的分子調(diào)控路徑，為右歸丸治療腎陽虛證的臨床療效提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 譚從娥，黃祥云，郭小青.應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選右歸丸對腎陽虛證干預(yù)效應(yīng)的血清差異表達(dá)蛋白[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（9）：2277-2279.

[2] SZKLARCZYK D， FRANCESCHINI A， WYDER S， et al. STRING v10： protein-protein interaction networks， integrated over the tree of life[J]. Nucleic Acids Res，2015，43（Database issue）：D447-D452.

[3] CARBON S， IRELAND A， MUNGALL C J， et al. AmiGO：online access to ontology and annotation data[J]. Bioinformatics，2009，25（2）：288-289.

[4] 李梢.中醫(yī)證候生物分子網(wǎng)絡(luò)標(biāo)志的構(gòu)想與研究[J].中醫(yī)雜志，2009， 50（9）：773-776.

[5] 譚從娥，王米渠.右歸丸對腎陽虛證患者干預(yù)效應(yīng)的差異表達(dá)基因功能網(wǎng)絡(luò)分析[J].中成藥，2013，35（9）：1875-1878.

[6] BREITKREUTZ B J， STARK C， TYERS M. Osprey：a network visualization system[J]. Genome Biol，2003，4（3）：R22.

[7] JU B H， PARK B， PARK J H， et al. Visualization and analysis of protein interactions[J]. Bioinformatics，2003，19（2）：317-318.

[8] DE NOOY W， MRVAR A， BATAGELJ V. Exploratory social network analysis with Pajek[M]. New York：Cambridge University Press， 2005：1-10.

[9] 昝琦，劉欣，逄越，等.補(bǔ)體C3結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30（4）：549-553.

[10] GUO R F， WARD P A. Role of C5a in inflammatory responses[J]. Annual Review of Immunology，2005，23：821-852.

（收稿日期：2015-04-20）

（修回日期：2015-05-27；編輯：陳靜）