◎ 石聲鑫

（汕頭市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東 汕頭 515041）

食品中丙烯酰胺的測定及其含量控制方法

◎ 石聲鑫

（汕頭市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東 汕頭 515041）

建立一種準確、方便的檢測食品中丙烯酰胺含量的高效液相色譜分析方法。樣品中的丙烯酰胺經(jīng)丙酮提取后，以甲醇-水溶液（5∶95）為流動相，C18色譜柱分離，二極管陣列檢測器檢測，檢測波長為210 nm，外標法定量。結(jié)果顯示，方法線性良好，檢出限為5 ng/g，RSD為0.53%～2.10%，回收率為86.3%～101.5%。運用該檢測方法，進一步探索減少食品中丙烯酰胺產(chǎn)生的措施，結(jié)果表明，將薯條油炸溫度降到180 ℃和在其原料中添加VC、纖維素可有效控制丙烯酰胺的產(chǎn)生，其中添加纖維素的效果明顯。

高效液相色譜；丙烯酰胺；食品；控制

丙烯酰胺是一種水溶性的塑膠單體化合物，是生產(chǎn)聚丙烯酰胺的原料。自2002年我國在油炸和燒烤的淀粉類食品首次檢出丙烯酰胺，其他國家也相繼報道類似結(jié)果[1,2]。目前，大部分學者認為丙烯酰胺的生成是天冬酰胺或谷氨酸等相似結(jié)構(gòu)的氨基酸及葡萄糖等經(jīng)過高溫加熱所致。丙烯酰胺具有潛在的致癌性、神經(jīng)毒性、遺傳毒性和生殖毒性[3,4]，人體可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸丙烯酰胺，在人體內(nèi)，丙烯酰胺生成活性環(huán)氧丙酰胺，這種物質(zhì)容易與DNA結(jié)合，形成絡合物，導致細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)損傷和基因突變。

丙烯酰胺的毒性引起全球研究人員的極大關注。①關于食品中丙烯酰胺含量的分析方法的研究。目前，食品中丙烯酰胺的檢測，國際上使用最多的方法有GC-MS法、LC-MS法、LC-MS-MS法等。我國制定的食品中丙烯酰胺檢測的標準有兩部[5,6]。大部分分析方法均需要經(jīng)過樣品脫脂凈化，加入同位素標記的丙烯酰胺作為內(nèi)標，樣品溴化衍生等步驟，過程繁瑣，被測組分在前處理過程損失較大，回收率低且測定誤差較大。②關于食品中丙烯酰胺含量控制的研究。我國是以糧谷類食物為主的國家，因此，建立食品中丙烯酰胺的快速準確檢測技術，探索其減少措施具有積極的現(xiàn)實意義。本課題擬采用HPLC-DAD研究食品中丙烯酰胺的測定方法，優(yōu)化前處理步驟和儀器分析條件，以建立食品中丙烯酰胺的快速準確檢測技術，并且從原料、生產(chǎn)工藝等方面研究，探索減少丙烯酰胺產(chǎn)生的措施。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Agilent1200高效液相色譜儀：Agilent1200型，配有二極管陣列檢測器DAD，美國Agilent公司；超聲波水浴器：英國GRANT XUB18；有機相濾膜：13 mm×0.22 μm，津騰儀器有限公司；甲醇、丙酮：色譜純；乙酸：分析純；丙烯酰胺：純度≥99.0%，250 mg，美國Sigma公司；丙烯酰胺標準儲備液：取10 mg丙烯酰胺（精確至0.1 mg），用甲醇溶解后定容于100 mL的棕色容量瓶中，配制成濃度為100 μg/mL丙烯酰胺的標準儲備液，貯存于-20 ℃冰箱中，使用時用水稀釋成標準工作溶液。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為10 μL。設置3種體積配比的流動相條件，甲醇-水溶液（A：5∶95，B：20∶80，C：60∶40）進行試驗，考察丙烯酰胺的標準溶液的色譜圖效果。

1.3 實驗方法

（1）標準曲線的制備。將標準貯備液用純水稀釋配制成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL和1.0 μg/mL的標準工作溶液，進液相色譜分析，以各標準峰的保留時間定性，峰面積外標法定量，繪制標準曲線。

（2）樣品前處理方法的優(yōu)化。分別用水、0.1%乙酸溶液、丙酮、5%甲醇溶液作為提取溶劑：分別稱取5份5 g（精確至0.01 g）均質(zhì)加標（加標量為2 μL）薯條樣品于10 mL容量瓶中，分別加入不同提取溶劑并定容至10 mL，加塞渦旋5 min后置于超聲波水浴中處理30 min，經(jīng)濾膜過濾后，進樣測定。

（3）精密度和加標回收率測定。選取曲奇、面包、薯條三種樣品，進行3水平添加回收試驗，每個添加水平取6個平行樣，進行回收率試驗。

（4）方法最低檢出限。選取空白樣品添加標準溶液，適當稀釋樣品的濃度，使其信噪比RSN≤3時樣品的濃度為方法的最低檢出限。

（5）控制丙烯酰胺含量的方法。選取未油炸的薯條樣品，將樣品分為9組，每組4個樣品，檢測每個樣品，根據(jù)檢測結(jié)果比較各組差異。具體工藝改進方法如下：①正常的油炸油溫為220 ℃左右，將油溫降至180 ℃左右和200 ℃左右。②兩組樣品中分別添加0.05 g/kg和0.1 g/kg的特丁基對苯二酚（TBHQ），經(jīng)正常油溫煎炸。③兩組樣品中分別添加0.2 g/kg和0.4 g/kg的維生素C（VC），經(jīng)正常油溫煎炸。④兩組樣品中分別添加0.5%纖維素和1.0%纖維素，經(jīng)正常油溫煎炸。比較4組成品中丙烯酰胺的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長和流動相比例的選擇

由于試樣中雜峰較多，易產(chǎn)生假陽性，本文取丙烯酰胺濃度為0.2 μg/mL的溶液，利用DAD檢測器對其進行紫外190～400 nm全波長掃描，確定210 nm為測定波長，360 nm為參比波長，便于篩除干擾物質(zhì)，初步定性待測組分后進一步定量，從而提了檢測的靈敏度，丙烯酰胺的吸收光譜如圖1所示。

圖1 丙烯酰胺的吸收光譜圖

改變流動相比例，分別對甲醇-水溶液按不同比例（A：5∶95，B：20∶80，C：60∶40）試驗。結(jié)果表明，流動相為甲醇-水溶液（5∶95）時，峰形對稱，重現(xiàn)型最好，效果最好（色譜圖如圖2所示）。

圖2 0.4 μg/mL丙烯酰胺標準溶液在A流動相比例下的高效液相色譜圖

2.2 線性關系

將濃度為0.02、0.1、0.2、0.4 μg/mL和1.0 μg/mL的丙烯酰胺標準溶液，在規(guī)定的色譜條件下測定，標準溶液所得的色譜峰峰面積和對應的濃度繪制成標準曲線，得到的標準曲線如圖3所示。

圖3 丙烯酰胺標準溶液標準曲線圖

測定結(jié)果表明，在0.05～1.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈線性關系，符合定量要求。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

分別采用水、0.1%乙酸溶液、丙酮、5%甲醇溶液作為提取溶劑對加標樣品進行前處理，測定其回收率。丙烯酰胺是極性小分子物質(zhì)且在酸性溶液中更加穩(wěn)定，采用水或極性強的有機溶劑萃取，在基質(zhì)復雜的食品中更好地提取包埋在脂肪微粒中的丙烯酰胺。結(jié)果見表1，加標回收試驗顯示4種溶劑均能達到90%以上，滿足檢測要求，尤以丙酮作為提取溶劑時提取效果最好，回收率達97%，同時在液相色譜上也有很好的分離。

表1 4種不同提取溶劑的回收率表（單位：%）

2.4 精密度、加標回收率和最低檢出限

選取曲奇、面包、薯條3種樣品進行3水平添加回收試驗，每個添加水平取6個平行樣，應用優(yōu)化后的方法進行回收率試驗，結(jié)果見表2。未加標的薯條樣品色譜圖和對應的加標色譜圖如圖4、圖5所示。該方法回收率為86.3%～101.5%，相對標準偏差為0.83%～2.15%，精密度較高。準確度和精密度符合丙烯酰胺的檢測要求。

選取空白餅干樣品添加丙烯酰胺，將含量依次降低的丙烯酰胺加入到樣品中去，對每個濃度樣品測定3次，記錄每次測得S/N值，結(jié)果顯示當添加5 ng/g時，S/N=3.1，因此該方法檢出限為5 ng/g。檢出限比國家標準方法的更低[5]，符合新的檢測要求。

表2 樣品添加不同濃度丙烯酰胺標樣的回收率及相對標準偏差表（單位：%）

圖4 未加標的薯條樣品色譜圖

圖5 加標的薯條樣品色譜圖

2.5 不同工藝條件丙烯酰胺的含量水平

按優(yōu)化的丙烯酰胺檢測方法，分別對不同工藝條件下成品薯條樣品的丙烯酰胺含量進行檢測，結(jié)果見表3。與正常組相比，在200 ℃時變化不大；而添加TBHQ后，丙烯酰胺含量反而有所增加；油溫降至180 ℃時、添加VC以及纖維素丙烯酰胺含量控制效果明顯，其中以1.0%纖維素添加量效果最優(yōu)，丙烯酰胺含量僅為正常組的28%。

表3 不同工藝條件下成品薯條丙烯酰胺的含量表

3 結(jié)果和討論

丙烯酰胺是極性小分子物質(zhì)，可用水或極性強的有機溶劑萃取。丙烯酰胺在酸性溶液中更加穩(wěn)定，但考慮到食品基質(zhì)復雜，本研究分別采用水、0.1%乙酸溶液、丙酮、5%甲醇溶液作為提取溶劑對樣品進行前處理。結(jié)果表明，4種溶劑均可較好地提取丙烯酰胺，均能滿足檢測要求，尤以丙酮作為提取溶劑時提取效果最好，可能是由于丙酮能更好地提取包埋在脂肪微粒中的丙烯酰胺。此前處理方法方便快捷，相比國家標準采用的氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）和國際上使用的液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS-MS），樣品前處理需經(jīng)過凈化、溴化衍生等步驟，可避免繁瑣步驟造成的成分損失，確保較高的回收率。HPLC方法操作簡便，更易于推廣，采用甲醇-水溶液（5∶95）作為流動相，丙烯酰胺有很好的分離效果，峰形完好，峰的保留時間和重現(xiàn)性均良好。從精密度、回收率和最低檢出限試驗中表明，該檢測方法靈敏度、精密度和準確度均較高，符合檢測要求。試驗證明該方法是一種準確、方便的測定食品中丙烯酰胺的分析方法。

在探索工藝方法控制食品中丙烯酰胺產(chǎn)生時，主要從溫度和抗氧化兩個方面考慮。通過將油溫降至180 ℃，成功地減少丙烯酰胺的產(chǎn)生，但在200 ℃時則無變化。從感官上看，與正常油溫炸出的薯條相比，180 ℃時顏色略淡，體積略小，口味則無大變化。因此，通過適當?shù)慕档图庸囟瓤蓽p少丙烯酰胺的產(chǎn)生，這也與文獻研究結(jié)果一致[7]，但不同的原料產(chǎn)品有不同的最佳加工溫度，這需要不斷地探索。原料添加TBHQ和VC后感官基本無影響，TBHQ的使用符合GB 2760-2011標準添允許的最大添加量[8]，但在使用TBHQ后對丙烯酰胺的抑制并不明顯，甚至有促進趨勢，這可能是高溫使抗氧化劑TBHQ發(fā)生反應，喪失抗氧化活性，或反應生產(chǎn)一種有利于丙烯酰胺生成的中間物質(zhì)；纖維素則對丙烯酰胺抑制效果明顯，且纖維素添加量越高，抑制效果越明顯，纖維素對丙烯酰胺產(chǎn)生的抑制機理可能是由于纖維素的添加可大大降低吸油率，減少裹粉中的油脂含量，增加裹粉的水分含量，因此在油炸過程中，水分被油脂置換受到限制，產(chǎn)生丙烯酰胺的褐變反應受到抑制。

4 結(jié)語

本研究結(jié)果表明，控制薯條油炸油溫在180 ℃和在原料中添加VC、纖維素可有效減少成品丙烯酰胺產(chǎn)生，但丙烯酰胺的產(chǎn)生是一個復雜的過程，其影響因素不僅與加工溫度和各種添加劑有關，還與加工時間、pH值、含水量、原料內(nèi)在成分和油的使用時間等的因素有關，值得進一步研究。

[1]Tareke E，Rydberg P，Karlsson P，et al. Analysis of acrylamide，a carcinogen formed in heated foodstuffs[J]. Journal of agricultural and food chemistry，2002（17）：4998-5006.

[2]Rosén J，Hellenas KE. Analysis of acrylamide in cooked foods by liquid chromatography tandem masss pectrometry[J].Anal，2002，127：880-882.

[3]Becalski A，La uBPY，Lewis D，et al. The 116thAOAC international annual meeting & exposition [R]. Los Angeles，CA，USA，Poster Abstract，2002.

[4]Sanders RA，Zyzak DV，Stojanovic M，et al. The 116thAOAC international annual meeting & exposition[R].Los Angeles，CA，USA，Noabstract available，2002.

[5]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB/T 5009.204-2014 食品安全國家標準 食品中丙烯酰胺的測定[S].北京：中國標準出版社，2014.

[6]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 2096-2008 食品中丙烯酰胺的檢測方法 同位素內(nèi)標法[S].北京：中國標準出版社，2008.

[7]Williams JSE. Influence of variety and processing conditions on acrylamide levels infried potato crisps [J]. Food Chemistry，2005（4）：875-881.

[8]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 2760-2014 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準[S].北京：中國標準出版社，2014.

Determination and the Control Methods of Acrylamide in Food

Shi Shengxin
(Shantou Supervison Testing Institute of Quality and Metrology, Shantou 515041, China)

An accurate and convenient method for the determination of acrylamide in food by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. The acrylamide was extracted with acetone and separated by a C18column with methanol - water (5∶95) as the mobile phase. The detection wavelength was set at 210 nm with a diode array detector and quantifed by external standard method. The detection limit was 5 ng/g, RSD was 0.53%～2.10%, and the recovery was 86.3%～101.5%. The results showed that the frying temperature of french fries was reduced to 180 ℃ and the addition of VC and cellulose in the raw materials could efectively control the production of acrylamide, and the addition of fber the efect is obvious.

HPLC; Acrylamide; Food; Control

O657.7

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.24.049