李 勇，耿建磊，檀碧波，范立僑，趙 群，劉 羽，劉慶偉

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胃癌組織核轉(zhuǎn)錄因子κB p65蛋白表達(dá)與腫瘤多藥耐藥性的關(guān)系

李 勇，耿建磊，檀碧波，范立僑，趙 群，劉 羽，劉慶偉

【摘要】目的分析胃癌組織中核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)p65蛋白表達(dá)與腫瘤多藥耐藥性(MDR)的關(guān)系，并探討其意義。方法選取2013年1—12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的68例胃癌患者的腫瘤組織及癌旁組織。采用免疫組化(SP)法檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)；采用體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)(MTT法)檢測(cè)胃癌組織細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶(5-FU)、長(zhǎng)春新堿(VCR)、紫杉醇(PTX)、奧沙利鉑(L-OHP)、表阿霉素(eADM)的體外化療藥物敏感性。結(jié)果胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2蛋白強(qiáng)表達(dá)率均高于癌旁組織，Bax蛋白強(qiáng)表達(dá)率低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織NF-κB p65與P-gp蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.321，P=0.008)，NF-κB p65與Bax蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.333，P=0.006)，NF-κB p65與Bcl-2蛋白表達(dá)無直線相關(guān)關(guān)系(rs=0.231，P=0.058)。在胃癌組織中，5-FU、PTX對(duì)NF-κB p65強(qiáng)表達(dá)者腫瘤細(xì)胞抑制率低于弱表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5-FU、PTX、L-OHP對(duì)P-gp強(qiáng)表達(dá)者腫瘤細(xì)胞抑制率低于弱表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5-FU、PTX、eADM對(duì)Bcl-2強(qiáng)表達(dá)者腫瘤細(xì)胞抑制率低于弱表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5-FU、L-OHP、eADM對(duì)Bax強(qiáng)表達(dá)者腫瘤細(xì)胞抑制率高于弱表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論胃癌組織中NF-κB p65表達(dá)增高，其可能通過調(diào)控P-gp、Bax蛋白表達(dá)而參與胃癌MDR。

化療是胃癌綜合治療的重要措施之一，但目前常用的化療方案效果均不能令人滿意，主要是由于胃癌細(xì)胞存在較強(qiáng)的多藥耐藥性(multidrugs resistance，MDR)[1-2]。闡明胃癌MDR的機(jī)制并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)可能提高化療效果、改善預(yù)后。但迄今關(guān)于胃癌MDR的機(jī)制還不完全明確。核轉(zhuǎn)錄因子кB(NF-κB)是轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，作為信號(hào)通路，NF-κB可調(diào)控多個(gè)下游基因表達(dá)，NF-κB p65蛋白是其中的重要成員[3-5]。有關(guān)NF-κB p65蛋白在胃癌MDR中作用的報(bào)道還不多見。為了解NF-κB p65蛋白在胃癌組織中表達(dá)情況及與胃癌MDR的關(guān)系，本研究檢測(cè)了NF-κB p65蛋白及胃癌MDR相關(guān)的P-糖蛋白(P-gp)、Bcl-2、Bax的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)方法檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞的體外化療敏感性，進(jìn)一步對(duì)NF-κB p65蛋白與胃癌MDR因子和化療敏感性的關(guān)系進(jìn)行分析，為探討NF-κB p65蛋白在胃癌MDR中發(fā)揮的作用提供了依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑兔抗人NF-κB p65單克隆抗體為美國Bioworld Technology公司產(chǎn)品，兔抗人P-gp、Bcl-2、Bax多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，免疫組化試劑盒購自美國ZYMED公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、MTT、胰蛋白酶為美國Gibico公司產(chǎn)品。氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)為上海旭東海普公司產(chǎn)品，長(zhǎng)春新堿(Vincristine，VCR)、紫杉醇(Paclitaxel，PTX)、表阿霉素(Epidoxorubicin，eADM)為浙江海正藥業(yè)公司產(chǎn)品，奧沙利鉑(Oxaliplatin，L-OHP)為江蘇恒瑞藥業(yè)公司產(chǎn)品。

1.1.2標(biāo)本來源及處理標(biāo)本來源于2013年1—12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的68例胃癌患者的腫瘤組織。68例患者中男38例，女30例；年齡42～77歲，中位年齡65歲。排除復(fù)發(fā)胃癌、合并其他惡性腫瘤及術(shù)前應(yīng)用過放化療者。術(shù)中標(biāo)本離體后取新鮮腫瘤組織1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm置入RPMI 1640培養(yǎng)液保存，在離體1 h內(nèi)由專人進(jìn)行研磨分散，準(zhǔn)備用于化療藥物敏感實(shí)驗(yàn)。另取標(biāo)本一份經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片后用于免疫組化(SP)染色。同時(shí)取癌旁組織一份(1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm)，距腫瘤邊緣≥3 cm，術(shù)后鏡下證實(shí)無癌細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定進(jìn)行SP法染色。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SP法檢測(cè)NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)采用SP法對(duì)腫瘤石蠟組織進(jìn)行染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行染色操作。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性切片作為陽性對(duì)照。由2位病理專業(yè)人員分別閱片進(jìn)行結(jié)果判斷。切片隨機(jī)取5個(gè)(×400)高倍視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，NF-κB p65以細(xì)胞核著染呈棕黃色為染色陽性，P-gp、Bcl-2、Bax以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)著染呈棕黃色為染色陽性，按腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率分別進(jìn)行計(jì)分。著色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞率計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；兩種計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)所得分值的乘積為0或1分表示陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～7分為陽性(++)，≥8分為強(qiáng)陽性(+++)。表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：≤3分為弱表達(dá)，≥4分為強(qiáng)表達(dá)。

1.2.2體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)(MTT法)腫瘤組織經(jīng)研磨分散，無菌條件下，用0.9%氯化鈉溶液漂洗組織2次，剪碎，放入0.25%胰蛋白酶消化液。細(xì)胞消化液經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，制成單細(xì)胞懸液。用已配置的RPMI 1640完全培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液；經(jīng)苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml接種于96孔板，100 μl/孔(含5×104個(gè)細(xì)胞)。使用前將腫瘤藥敏檢測(cè)板和DMEM培養(yǎng)基預(yù)溫至37 ℃。將5種受試藥物分別加入腫瘤細(xì)胞懸液中，分別為5-FU 10 μg/ml、VCR 0.5 μg/ml、PTX 10 μg/ml、L-OHP 20 μg/ml、eADM 0.4 μg/ml[6]?？瞻捉M加入磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對(duì)照。接種細(xì)胞懸液200 μl/孔，微量振蕩器振蕩混勻，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)3～24 h，依據(jù)顯微鏡下觀察MTT還原形成藍(lán)色針狀結(jié)晶終止培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)板以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，吸水紙吸去殘留液體。加入DMSO 100 μl/孔，輕輕振蕩混勻，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)各孔吸光度(A)值。腫瘤細(xì)胞平均抑制率(IR)=(1-給藥孔平均A值)/對(duì)照孔平均A值×100%。

2結(jié)果

2.1胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)情況胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2蛋白強(qiáng)表達(dá)率均高于癌旁組織，Bax蛋白強(qiáng)表達(dá)率低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的關(guān)系Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織NF-κB p65與P-gp蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.321，P=0.008)，NF-κB p65與Bax蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.333，P=0.006)，Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.401，P=0.001)，NF-κB p65與Bcl-2、P-gp與Bax蛋白表達(dá)無明顯相關(guān)關(guān)系(rs=0.231，P=0.058；rs=-0.196，P=0.108)。

2.3胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)與化療藥物敏感性的關(guān)系在胃癌組織中，5-FU、PTX對(duì)NF-κB p65強(qiáng)表達(dá)者腫瘤細(xì)胞抑制率低于弱表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5-FU、PTX、L-OHP對(duì)P-gp強(qiáng)表達(dá)者腫瘤細(xì)胞抑制率低于弱表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5-FU、PTX、eADM對(duì)Bcl-2強(qiáng)表達(dá)者腫瘤細(xì)胞抑制率低于弱表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5-FU、eADM、L-OHP對(duì)Bax強(qiáng)表達(dá)者腫瘤細(xì)胞抑制率高于弱表達(dá)者(P<0.05，見表2)。

3討論

研究證明胃癌細(xì)胞對(duì)不同作用機(jī)制的化療藥物存在明顯抵抗作用，稱為MDR[7]。胃癌細(xì)胞的這種特性是導(dǎo)致化療失敗的直接原因，也是胃癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及死亡的重要因素。胃癌MDR是多種相關(guān)基因及信號(hào)通路相互調(diào)控、共同作用的結(jié)果[8]。胃癌MDR的作用機(jī)制復(fù)雜，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)其中的關(guān)鍵調(diào)控分子，因而胃癌MDR逆轉(zhuǎn)的研究也尚未取得突破性進(jìn)展。NF-κB是具有廣泛作用的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，參與細(xì)胞的多種生理病理過程。NF-κB p65蛋白是NF-κB家族中重要成員，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB p65蛋白在多種惡性腫瘤中存在表達(dá)增高現(xiàn)象，并參與多種腫瘤的MDR[9-11]。本研究結(jié)果也顯示，NF-κB p65蛋白在胃癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，且5-FU、PTX對(duì)NF-κB p65蛋白強(qiáng)表達(dá)者腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯低于弱表達(dá)者，提示NF-κB p65蛋白可能參與了胃癌發(fā)生，并且NF-κB p65蛋白強(qiáng)表達(dá)時(shí)胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU、PTX的敏感性降低，參與了胃癌MDR。但本研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)VCR、L-OHP、eADM的敏感性與NF-κB p65蛋白表達(dá)無關(guān)，提示NF-κB p65蛋白可能僅參與了部分化療藥物的耐藥調(diào)控，但具體情況還應(yīng)擴(kuò)大研究規(guī)模并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

為了解NF-κB p65蛋白參與胃癌MDR的可能機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了胃癌MDR相關(guān)蛋白P-gp、Bcl-2、Bax的表達(dá)，分析了其與NF-κB p65蛋白的關(guān)系。P-gp是經(jīng)典MDR的重要蛋白，與VCR、VP-16等植物化療藥的耐藥有關(guān)。P-gp的主要功能是將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的藥物以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)(藥泵)的方式排出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致藥物的效果降低[12]。本研究結(jié)果顯示，P-gp在胃癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，P-gp表達(dá)增高時(shí)胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU、PTX、L-OHP的耐藥性增強(qiáng)。與本課題組前期研究結(jié)果符合[1]。本研究結(jié)果亦顯示，胃癌組織NF-κB p65蛋白與P-gp蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示NF-κB p65可能通過促進(jìn)P-gp表達(dá)而參與胃癌MDR。Bcl-2是細(xì)胞中線粒體途徑的凋亡抑制基因，具有通過增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡抵抗能力而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的作用[13]。而Bax則具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，可與Bcl-2結(jié)合成Bcl-2/Bax二聚體而發(fā)揮作用，Bcl-2與Bax的比值決定了細(xì)胞凋亡水平的改變[14]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織較癌旁組織Bcl-2表達(dá)增高、Bax表達(dá)降低，提示胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的凋亡抵抗能力，這是胃癌MDR的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2強(qiáng)表達(dá)與5-FU、PTX、eADM的耐藥性有關(guān)，而Bax強(qiáng)表達(dá)則與5-FU、L-OHP、eADM的耐藥性有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NF-κB p65蛋白與Bax蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示NF-κB p65蛋白可能具有抑制Bax表達(dá)的作用，是其參與胃癌MDR的另一機(jī)制。

表1　胃癌組織與癌旁組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較〔n(%)〕

注：NF-κB p65=核轉(zhuǎn)錄因子кB p65，P-gp=P-糖蛋白

Table 2Comparison of inhibition rate of chemotherapy drugs between gastric cancer tissues with weak expression of NF-κB p65，P-gp，Bcl-2 and Bax and tissues with strong expression

蛋白表達(dá)例數(shù)化療藥物抑制率5-FU VCR PTX eADM L-OHP蛋白表達(dá)例數(shù)化療藥物抑制率5-FU VCR PTX eADM L-OHPNF-κBp65Bcl-2 弱表達(dá)3135.38±7.4331.83±9.9442.68±11.4626.84±7.3239.34±6.26 弱表達(dá)3236.75±10.2633.80±9.4145.07±11.2932.82±6.2537.63±7.36 強(qiáng)表達(dá)3731.27±8.7632.95±10.6835.62±9.8925.42±8.3737.38±7.21 強(qiáng)表達(dá)3631.64±9.7331.02±7.4638.16±8.2724.60±5.9135.62±5.38 t值2.063-0.4442.7270.7371.185 t值2.1071.3572.9015.5721.295 P值0.043 0.6580.0080.4640.240 P值0.0390.1790.005<0.0010.200P-gpBax 弱表達(dá)2834.68±6.1833.42±6.7343.24±10.2629.61±8.3640.63±8.32 弱表達(dá)5130.84±8.5431.44±7.3338.91±9.2324.18±6.1630.34±6.82 強(qiáng)表達(dá)4028.42±7.2230.43±9.2234.36±8.9326.82±7.0834.32±7.94 強(qiáng)表達(dá)1738.39±7.3233.16±6.5343.64±6.3832.21±8.8238.14±9.37 t值3.7291.4633.7951.4843.162 t值-3.263-0.860-1.958-4.156-3.705 P值<0.0010.148<0.0010.1430.002 P值0.0020.3930.054<0.001<0.001

注：5-FU=氟尿嘧啶，VCR=長(zhǎng)春新堿，PTX=紫杉醇，eADM=表阿霉素，L-OHP=奧沙利鉑

本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB p65蛋白在胃癌組織中表達(dá)增高，可能通過調(diào)控P-gp、Bax表達(dá)而參與胃癌MDR。但本研究?jī)H對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)論多為推測(cè)而來。進(jìn)一步研究中準(zhǔn)備應(yīng)用NF-κB通路阻斷劑及基因干擾技術(shù)對(duì)胃癌細(xì)胞中NF-κB通路進(jìn)行干預(yù)，對(duì)干預(yù)后腫瘤細(xì)胞MDR特性的改變及機(jī)制進(jìn)行深入研究，以發(fā)現(xiàn)NF-κB參與腫瘤MDR的確切機(jī)制。

多藥耐藥性(MDR)

腫瘤MDR并非多重耐藥。MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶點(diǎn)相異的抗腫瘤藥也產(chǎn)生交叉性耐藥的現(xiàn)象。MDR包括原發(fā)性(先天性)耐藥(natural MDR)和繼發(fā)性耐藥(acquired MDR)：原發(fā)性耐藥是腫瘤細(xì)胞固有的對(duì)化療藥物不敏感，故首次使用化療藥物就產(chǎn)生耐藥；繼發(fā)性耐藥指腫瘤初始對(duì)化療藥物敏感，但經(jīng)過化療藥物作用后產(chǎn)生的MDR現(xiàn)象。

作者貢獻(xiàn)：李勇進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、研究質(zhì)量控制、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；耿建磊、檀碧波、范立僑、趙群、劉羽、劉慶偉進(jìn)行了資料收集、實(shí)驗(yàn)實(shí)施及結(jié)果分析、統(tǒng)計(jì)處理等工作。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

·用藥分析·

【關(guān)鍵詞】胃腫瘤；多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)類；核轉(zhuǎn)錄因子κB

李勇，耿建磊，檀碧波，等.胃癌組織核轉(zhuǎn)錄因子κB p65蛋白表達(dá)與腫瘤多藥耐藥性的關(guān)系[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(2)：238-241.[www.chinagp.net]

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Relationship Between the Protein Expression of Nuclear Transcription Factors κB p65 and Multidrug Resistance in Gastric CancerLIYong，GENGJian-lei，TANBi-bo，etal.ThirdDepartmentofGeneralSurgery，theFourthAffiliatedHospital，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between the protein expression of gastric cancer tissue nuclear transcription factors κB(NF-κB)p65 and the multidrug resistance(MDR)of tumor and explore its significance.MethodsWe collected the tumor tissue and para-carcinoma tissue of 68 patients who were pathologically diagnosed with gastric carcinoma and underwent excision surgery in the Third Department of General Surgery of the Fourth Affiliated Hospital，Hebei Medical University from January 2013 to December 2013.Using immunohistochemical SP method，the protein expression levels of NF-κB p65，P-gp，Bcl-2 and Bax in the collected tissues were detected.Using MTT method，the sensitivity of gastric cancer cells towards 5-FU，VCR，PTX，L-OHP and eADM was measured.ResultsThe strong expression incidence of NF-κB p65，P-gp，Bcl-2 proteins in cancer tissues was higher than that in para-carcinoma tissues，while Bax protein in cancer tissues was lower than that in para-cancer tissues(P<0.05).Spearman correlation analysis showed that positive relationship was found between the expression levels of NF-κB p65 and P-gp(rs=0.321，P=0.008)；expression of NF-κB p65 and that of Bax had negative correlation(rs=-0.333，P=0.006)，and the expression of NF-κB p65 had no significant correlation with that of Bcl-2(rs=0.231，P=0.058).In gastric cancer tissues with strong expression of NF-κB p65，the inhibition rates of 5-FU and PTX for cancer cells were lower than those tissues with weak expression of NF-κB p65(P<0.05)；in tissues with strong expression of P-gp，the inhibition rates of 5-FU，PTX and L-OHP for cancer cells were lower than tissues with weak expression of P-gp(P<0.05)；inhibition rates of 5-FU，PTX，eADM to cancer cells were lower in tissues with strong expression of Bcl-2 than tissues with weak expression of Bcl-2(P<0.05)，whereas in tissues with strong expression of Bax，inhibition rates of 5-FU，L-OHP and eADM to cancer cells were higher than tissues with weak expression of Bax(P<0.05).ConclusionGastric cancer tissues have higher expression of NF-κB p65 which might be involved in MDR of gastric cancer by regulating P-gp and Bax proteins.

【Key words】Stomach neoplasms；Multidrug resistance-associated proteins；NF-κB

收稿日期：(2015-07-21；修回日期：2015-11-06)

【中圖分類號(hào)】R 735.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.02.024

通信作者：李勇，050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科；E-mail：liyonghbth@126.com

基金項(xiàng)目：作者單位：050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科(李勇，檀碧波，范立僑，趙群，劉羽，劉慶偉)；河北省兒童醫(yī)院普外科(耿建磊)