吳 進(jìn)，劉慶軍，曾文容，吳采榮，戴立林，陳志達(dá)

(廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院骨科， 福建 漳州 363000)

?應(yīng)用基礎(chǔ)研究?

沉默Ether à go-go 1基因調(diào)控VEGF/PI3K/AKT抑制骨肉瘤增殖和血管生成的研究*

吳 進(jìn)，劉慶軍，曾文容，吳采榮，戴立林，陳志達(dá)△

(廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院骨科， 福建 漳州 363000)

目的：檢測(cè)沉默Ether à go-go 1 (Eag1) 基因?qū)侨饬鲈鲋澈脱苌傻挠绊懠捌淇赡艿恼{(diào)控機(jī)制。方法： 構(gòu)建抑制Eag1表達(dá)的短發(fā)卡RNA (short hair RNA, shRNA) 重組腺病毒載體Ad5-Eag1-shRNA并感染骨肉瘤細(xì)胞株。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) (real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR) 和蛋白印跡技術(shù) (Western blot analysis, WB) 檢測(cè)Ad5-Eag1-shRNA的感染效能。采用CCK-8法和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染前后骨肉瘤細(xì)胞增殖和裸鼠骨肉瘤體積的變化。采用免疫組化技術(shù)和WB技術(shù)分別檢測(cè)感染前后裸鼠腫瘤組織中微血管密度 (microvessel density, MVD) 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 表達(dá)的變化。采用WB技術(shù)檢測(cè)感染前后骨肉瘤細(xì)胞中VEGF、磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphoinositide 3-kinase, PI3K) 和蛋白激酶B (protein kinase B, AKT) 的表達(dá)變化。結(jié)果： 構(gòu)建的重組腺病毒載體Ad5-Eag1-shRNA具有良好的感染效能。感染Ad5-Eag1-shRNA可沉默骨肉瘤中Eag1的表達(dá)并能有效地抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng) (均P<0.001)，同時(shí)下調(diào)裸鼠骨肉瘤組織中MVD密度和VEGF的表達(dá) (均P<0.001)。感染Ad5-Eag1-shRNA可下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá) (P<0.05) 并抑制PI3K和AKT的磷酸化 (均P<0.001)。結(jié)論： 沉默Eag1可能通過(guò)調(diào)控VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路抑制骨肉瘤增殖和血管生成。

Ether à go-go 1基因； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 骨肉瘤； 細(xì)胞增殖； 血管生成

骨肉瘤是青少年最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。即使采用外科保肢手術(shù)聯(lián)合新輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，無(wú)肺轉(zhuǎn)移患者5年生存率僅為60～75%，發(fā)生肺轉(zhuǎn)移患者預(yù)后更差[2-3]。近年來(lái)，骨肉瘤基因治療已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但很多基因治療缺乏特異性靶向，體外實(shí)驗(yàn)效果優(yōu)于體內(nèi)試驗(yàn)[4]，因此，急需要尋找更有效的治療基因來(lái)突破骨肉瘤患者生存預(yù)后的瓶頸。

近期的研究發(fā)現(xiàn)一些電壓門(mén)控型鉀離子通道的亞型異常表達(dá)于多種類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞中并參與了腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，提示這些電壓門(mén)控型鉀離子通道有可能成為腫瘤分子治療的新靶點(diǎn)[5]。Eag1電壓門(mén)控型鉀離子通道為Eag1基因編碼，是第一個(gè)被證明與腫瘤密切相關(guān)的電壓門(mén)控性鉀離子通道。我們之前的研究亦證實(shí)Eag1基因參與了骨肉瘤增殖、周期等過(guò)程[6]，但其對(duì)骨肉瘤血管生成的作用尚未明確。本研究中，我們首先構(gòu)建了抑制Eag1表達(dá)的shRNA 重組腺病毒載體，之后利用該載體感染骨肉瘤細(xì)胞并檢測(cè)了沉默Eag1表達(dá)對(duì)骨肉瘤增殖、生長(zhǎng)和血管生成的影響，最后初步闡明其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料、試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無(wú)胸腺的BALB/c的雌性裸鼠 (鼠齡4～6周) 購(gòu)買(mǎi)自廈門(mén)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。細(xì)胞：人骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞和人源胚胎腎293細(xì)胞 (HEK293)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞裂解液購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Invitrogen公司，pGeneSil-1質(zhì)粒和免疫組化試劑盒購(gòu)買(mǎi)自武漢賽晶公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)買(mǎi)自日本Takara公司，CCK-8試劑盒購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Dojindo公司，瓊脂糖購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma公司，Eag1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)、磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(phospho-phosphoinositide 3-kinase, p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B (phospho-protein kinase B, p-AKT)、總的PI3K (total-PI3K, t-PI3K)、總的AKT (total-AKT, t-AKT)、GAPDH和其他相關(guān)抗體購(gòu)買(mǎi)自英國(guó)Abcam公司，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Millipore公司，Real-time PCR所需的引物設(shè)計(jì)并購(gòu)買(mǎi)自上海生工公司。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國(guó)Thermo Scientific公司)、GeneAmp 2400 PCR儀 (美國(guó) ABI公司)、凝膠成像系統(tǒng) (美國(guó)Alpha Innotech 公司)、Mini PROTEAN蛋白電泳設(shè)備 (美國(guó) Bio Rad 公司)和M200多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤MG-63細(xì)胞和人HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基 (含10%小牛血清、100U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)。細(xì)胞均置于37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)及傳代。

1.3 重組腺病毒載體的構(gòu)建和感染

設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Eag1的shRNA的靶DNA序列 (根據(jù)Eag1基因全序列設(shè)計(jì)為：AGC CAT CTT GGT CCC TTA TAA)，克隆于穿梭載體pAdTrack-CMV中，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1在BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝得到含sh-Eag1的重組腺病毒并命名為Ad5-Eag1-shRNA。同時(shí)設(shè)計(jì)合成一對(duì)照的重組腺病毒并命名為Ad5-Control-shRNA。感染前1天，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的500μL的骨肉瘤MG-63細(xì)胞懸液 (1×106個(gè)/mL) 接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，使用Ad5-Eag1-shRNA或Ad5-Control-shRNA以5感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI) 的濃度進(jìn)行細(xì)胞感染。

1.4 CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

100μL細(xì)胞懸液 (1×105/mL) 均勻分布于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后感染Ad5-Eag1-shRNA或Ad5-Control-shRNA。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48或72h后，加入10μL CCK-8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1h，終止培養(yǎng)。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔光吸收值。與實(shí)驗(yàn)平行，加細(xì)胞、培養(yǎng)基不加抑制劑的組為陽(yáng)性對(duì)照組；與實(shí)驗(yàn)平行，只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞的組設(shè)置為空白對(duì)照組，比色時(shí)空白對(duì)照組調(diào)零。按照公式：細(xì)胞存活率(%) = 實(shí)驗(yàn)組吸光值/陽(yáng)性對(duì)照吸光值×100%。

1.5 Real-time PCR

用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟制備cDNA。在GeneAmp 2400 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，使用2400 SDSv2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。擴(kuò)增條件為：95℃變性15s，60℃退火30s，74℃檢測(cè)3s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動(dòng)得出溶解曲線(xiàn)。采用primer premier 5.0軟件參照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出 PCR引物序列，經(jīng)序列驗(yàn)證確認(rèn)引物序列與其他基因無(wú)匹配。Eag1上游引物 5’-GCTTTTGAGAACGTGGATGAG-3’，下游引物5’-CGAAGATGGTGGCATAGAGAA-3’。 β-actin 上游引物 5’-TCCACCTTCCAGCAGATGTG-3’，下游引物 5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’。

1.6 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

無(wú)胸腺的BALB/c的雌性裸鼠 (鼠齡4～6周) 實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)均在 SPF 條件下的超凈層流架中進(jìn)行，滅菌處理的水和飼料供動(dòng)物自由攝入。將18只裸鼠按簡(jiǎn)單隨機(jī)法分為3組，即對(duì)照組、Ad5-Eag1-shRNA組和Ad5-Control-shRNA組。實(shí)驗(yàn)步驟如下：MG-63細(xì)胞感染Ad5-Eag1-shRNA或Ad5-Control-shRNA或未經(jīng)任何處理后繼續(xù)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨肉瘤細(xì)胞，用 0.02%EDTA和 0.125%的胰蛋白酶聯(lián)合消化，收集細(xì)胞用無(wú)血清 RPMI-1640定容。 按1×106mL濃度接種于裸鼠的左后肢背側(cè)。移植完成后，逐日觀察移植部有無(wú)感染，腫瘤生長(zhǎng)后有無(wú)自然消退，每周測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑 a 和短徑 b。按如下公式計(jì)算腫瘤體積曲線(xiàn)：V(腫瘤體積)=ab2/2。

1.7 組織切片和免疫組化

處死裸鼠后取出腫瘤組織，用10%福爾馬林溶液固定24～48h。先經(jīng)梯度乙醇脫水后用二甲苯透明，然后入溶融的石蠟中浸透每次30min，共3次；再包埋。包埋好的石蠟塊進(jìn)行切片；切片的厚度為4μm。切片脫蠟至水后，放入盛有0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液 (pH6.0，工作液) 沸騰修復(fù)抗原， 4℃下CD31抗體孵育過(guò)夜，之后步驟參照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用Image J軟件分析10個(gè)隨機(jī)高倍視野下(200 ×) CD31的陽(yáng)性染色以評(píng)估腫瘤組織微血管生成情況。

1.8 蛋白印跡技術(shù)(Western bolt analysis, WB)

取5～6×107個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞30min，收集裂解物，在 4℃下12 000 r/min離心約10min，取上清液，用二鋅可酸(bicinchonininc acid, BCA) 法測(cè)定蛋白濃度后，-80℃保存。上樣前把樣品置于沸水浴中5min，然后進(jìn)行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)，在100V恒壓電泳2h，電轉(zhuǎn)膜儀30V濕法轉(zhuǎn)膜1.5h。用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液鹽水(phosphate buffered saline Tween,PBST) 室溫封閉1h，倒掉封閉液，然后在室溫下分別用Eag1，VEGF，p-PI3K, p-AKT，t-PI3K，t-AKT和GAPDH抗體4℃冰箱孵育過(guò)夜，用PBST洗滌3次，10min/次，加入相對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1.5h，用PBST洗滌3次，10min/次；采用ECL顯色法檢測(cè)，內(nèi)參為GAPDH，用凝膠成像分析軟件分析條帶凈灰度，用各組目的蛋白的灰度值與內(nèi)參的灰度值相比，所得結(jié)果為目的蛋白的相對(duì)含量，表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤) (Mean±SEM) 表示，采用SPSS18.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析。采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析 (ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒載體效能的檢測(cè)

Real-time PCR (圖1A) 和WB (圖1B) 結(jié)果顯示：構(gòu)建的抑制Eag1表達(dá)的shRNA重組腺病毒載體Ad5-Eag1-shRNA具有良好的效能，能從mRNA和蛋白水平有效地抑制Eag1的表達(dá)，與空白組 (未行任何處理) 和Ad5-Control-shRNA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.001)。

圖1 Ad5-Eag1-shRNA干擾效能的檢測(cè)

A. mRNA水平檢測(cè)Ad5-Eag1-shRNA 對(duì)Eag1表達(dá)的影響 B. 蛋白水平檢測(cè)Ad5-Eag1-shRNA 對(duì)Eag1表達(dá)的影響

注：***P<0.001

2.2 Ad5-Eag1-shRNA對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示：感染Ad5-Eag1-shRNA后，骨肉瘤MG-63細(xì)胞存活率在24h[ (87.1±5.1)%,t=4.225，P<0.001]、36h[(79.2±5.2)%,t=7.014，P<0.001]、48h[(65.6±6.9)%,t=9.535，P<0.001] 和72h[ (53.1±5.8)%,t=16.860，P<0.001] 時(shí)均明顯低于Ad5-Control-shRNA組 [24h:(96.1±1.1)%、36h:(95.6±2.4)%、48h:(94.3±2.6)%、72h:(94.9±1.8)%)]，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖2)。由此可見(jiàn)，下調(diào)Eag1表達(dá)可有效地抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。

圖2 Ad5-Eag1-shRNA對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響

感染Ad5-Eag1-shRNA可有效地抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖。從第24 h起，Ad5-Eag1-shRNA組的細(xì)胞存活率明顯低于Ad5-Control-shRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：***P<0.001。

2.3 Ad5-Eag1-shRNA對(duì)裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng)的影響

裸鼠腫瘤結(jié)果顯示：感染Ad5-Eag1-shRNA后第6天，Ad5-Eag1-shRNA組 (271.922±26.39)mm3裸鼠腫瘤體積明顯小于Ad5-Control-shRNA組 (473.1831±32.85 )mm3和對(duì)照組 (460.7363±38.89)mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (分別為t=11.707，P<0.001；t=5.797，P<0.001)。第8、10、12天，Ad5-Eag1-shRNA組裸鼠腫瘤體積均明顯小于Ad5-Control-shRNA組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.001) (圖3)。由此可見(jiàn)，下調(diào)Eag1表達(dá)還可從體內(nèi)水平有效地抑制骨肉瘤生長(zhǎng)。

2.4 Ad5-Eag1-shRNA對(duì)裸鼠骨肉瘤組織血管生成的影響

免疫組化結(jié)果顯示 (圖4A)：Ad5-Eag1-shRNA組每個(gè)高倍視野下MVD數(shù)為5.0±2.7 (基于CD31陽(yáng)性染色率)，Ad5-Control-shRNA組每個(gè)高倍視野下MVD數(shù)為17.8±1.9，對(duì)照組每個(gè)高倍視野下MVD數(shù)為19.5±3.1。與Ad5-Control-shRNA組和對(duì)照組相比，Ad5-Eag1-shRNA可明顯下調(diào)裸鼠骨肉瘤組織微血管的生成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.001)。WB結(jié)果顯示 (圖4B)：Ad5-Eag1-shRNA組中VEGF的表達(dá)量明顯低于Ad5-Control-shRNA組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.001)。由此可見(jiàn)，下調(diào)Eag1表達(dá)可能通過(guò)抑制裸鼠骨肉瘤微血管生成抑制腫瘤生長(zhǎng)。

圖3 Ad5-Eag1-shRNA對(duì)裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng)的影響

從第6天起，Ad5-Eag1-shRNA組裸鼠骨肉瘤體積明顯小于對(duì)照組和Ad5-Control-shRNA組。

注：***P<0.001。

2.5 Ad5-Eag1-shRNA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

WB結(jié)果顯示：Ad5-Eag1-shRNA可明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)并呈時(shí)間依賴(lài)效應(yīng) (均P<0.05) (圖5A)。進(jìn)一步的研究表明：Ad5-Eag1-shRNA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中t-PI3K和t-AKT的表達(dá)無(wú)明顯影響，但可明顯下調(diào)p-PI3K和p-AKT的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.001) (圖5B)。

3 討 論

1969年，Kaplan等在《Genetics》雜志上首次報(bào)道了一種可以使成年雄性黑腹果蠅腿部在麻醉狀態(tài)下發(fā)生緩慢而規(guī)律運(yùn)動(dòng)的基因[7]，人們將其命名為ether à go-go (Eag)，其性質(zhì)為一種電壓門(mén)控性鉀離子通道。之后的研究證實(shí)Eag亞族包括兩個(gè)成員：Eag1和Eag2。1999年，Pardo等在《EMBO J》雜志上發(fā)表了里程碑式的文章[8]，首次證實(shí)了Eag1與腫瘤密切相關(guān)[9]。進(jìn)一步的研究表明Eag1在多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中高表達(dá)，而在相應(yīng)來(lái)源的正常細(xì)胞和組織中不表達(dá)或低表達(dá) (主要表達(dá)于腦組織，短暫性表達(dá)于胎盤(pán)和肌原細(xì)胞)[5]。一些致癌因素，如HPV感染、雌激素和致癌物等均可誘導(dǎo)其高表達(dá)[10]，提示Eag1具有致癌潛能并可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物。

圖4 Ad5-Eag1-shRNA對(duì)裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng)的影響

A.腫瘤組織免疫組化CD31染色(200 ×) a:對(duì)照組；b: Ad5-Control-shRNA組；c: Ad5-Eag1-shRNA組(箭頭所示：CD31陽(yáng)性染色)。

B.不同組別腫瘤組織內(nèi)VEGF表達(dá)情況。

注：***P<0.001。

圖5 Ad5-Eag1-shRNA對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞中VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

A.Ad5-Eag1-shRNA 在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞中VEGF表達(dá)的影響。

B.Ad5-Eag1-shRNA對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞中PI3K和AKT表達(dá)的影響。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

本項(xiàng)目組前期研究亦表明下調(diào)人骨肉瘤中異常高表達(dá)的Eag1可抑制骨肉瘤惡性表型[6]，但其調(diào)控骨肉瘤惡性表型的機(jī)制尚未明確。

腫瘤新生血管生成是惡性腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。研究證實(shí)有多種活性物質(zhì)可調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，其中VEGF是腫瘤來(lái)源的重要的促血管生成因子，不僅由腫瘤細(xì)胞分泌，也可由腫瘤相關(guān)的間質(zhì)細(xì)胞分泌，具有刺激血管生成、血管發(fā)生、炎癥形成和增加血管滲透性等作用[11]。因此，本項(xiàng)目設(shè)想Eag1參與了骨肉瘤血管生成的過(guò)程并進(jìn)行了相關(guān)的研究。

本研究首先設(shè)計(jì)并構(gòu)建了抑制Eag1表達(dá)的shRNA重組腺病毒載體Ad5-Eag1-shRNA并檢測(cè)其效能。結(jié)果顯示構(gòu)建的Ad5-Eag1-shRNA可從mRNA和蛋白水平有效地抑制Eag1的表達(dá)。之后的研究證實(shí)，Ad5-Eag1-shRNA還從體內(nèi)和體外水平顯著地抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng)。進(jìn)一步的研究表明：采用Ad5-Eag1-shRNA下調(diào)Eag1表達(dá)可抑制裸鼠骨肉瘤微血管生成，這可能與腫瘤組織中VEGF的表達(dá)受限有關(guān)。在細(xì)胞水平，我們證實(shí)了上述的結(jié)論。感染Ad5-Eag1-shRNA可明顯抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。最后我們初步探討了可能的機(jī)制。眾所周知，PI3K/AKT信號(hào)通路是VEGF下游重要的信號(hào)通路之一，參與了腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等諸多過(guò)程[12]。因此，我們還研究Ad5-Eag1-shRNA對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。研究表明：Ad5-Eag1-shRNA可明顯地抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活(即抑制PI3K和AKT的磷酸化水平，但對(duì)PI3K和AKT的總量確無(wú)明顯影響)，提示VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路可能參與了Eag1調(diào)控骨肉瘤血管生成的過(guò)程。

綜上所述，沉默Eag1可能通過(guò)調(diào)控VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路抑制骨肉瘤增殖和血管生成，但具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

[1] 趙亞恒, 馮和林，鄭麗華，等. 骨肉瘤發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 腫瘤防治研究, 2014, 41(3):283-286.

[2] Schwab JH, Springfield DS, Raskin KA, et al. What’s new in primary bone tumors [J]. J Bone Joint Surg Am, 2012, 94(20):1913-1919.

[3] Lutetke A, Meyers PA, Lewis I, et al. Osteosarcoma treatment-Where do we stand? A state of the art review [J]. Cancer Treat Rev, 2014, 40(4):523-532.

[4] 浦飛飛, 邵增務(wù).骨肉瘤基因治療研究進(jìn)展 [J].國(guó)際骨科學(xué)雜志, 2013, 34(3): 193-195.

[5] Pardo LA, Sühmer W. The roles of K(+)channels in cancer [J]. Nat Rev Cancer, 2014, 14(1): 39-48.

[6] Wu J, Zhong D, Fu X, et al. Silencing of Ether à Go-Go 1 by shRNA inhibits osteosarcoma growth and cell cycle progression [J]. Int J Mol Sci, 2014,15(4):5570-5581.

[7] Kaplan WD, Trout WE 3rd. The behavior of four neurological mutants of Drosophila [J]. Genetics, 1969,61(2):399-409.

[8] Pardo LA, del Camino D, Sánchez A, et al. Oncogenic potential of EAGK(+) channels [J]. EMBO J, 1999,18(20):5540-5547.

[9] Ding XW, Yan JJ, An P, et al. Aberrant expression of ether à go-go potassium channel in colorectal cancer patients and cell lines [J]. World J Gastroenterol，2007,13(8):1257-1261.

[11]羅翠蓮, 文慶蓮. 腫瘤抗血管生成治療耐藥分子機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 腫瘤預(yù)防與治療, 2014, 27(1):33-38.

[12]Los M, Voest EE, Borel Rinkes IH. VEGF as a target of therapy in gastrointestinal oncology [J]. Dig Surg, 2005, 22(4):282-293.

Ether à go-go 1 (Eag1) Knockdown Inhibits Human Osteosarcoma Proliferation and Angiogenesis via VEGF/PI3K/AKT Signaling

Wu Jin, Liu Qingjun, Zeng Wenrong, et al

(DepartmentofOrthopaedics,TheAffiliatedSoutheastHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou363000,Fujian,China)

Objective: To detect the influence of Eag1 knockdown on the proliferation and angiogenesis of osteosarcoma and the mechanism of Eag1 regulation. Methods: A recombinant adenovirus vector Ad5-Eag1-shRNA against the expression of Eag1 was constructed and the osteosarcoma cells were infected. The knockdown efficiency of Ad5-Eag1-shRNA was tested by real-time PCR and Western blotting (WB). The influence of Eag1 knockdown on the proliferation and growth of osteosarcoma was measured using CCK-8 and xenograft model of nude mice. The effect of Eag1 silencing on the intratumoral microvessel density (MVD) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was investigated by the immunohistochemistry and western blot analysis. WB was used to detect the expression of VEGF, phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and protein kinase B (AKT) in osteosarcoma cells before and after infected with Ad5-Eag1-shRNA. Results: High knockdown efficiency of Ad5-Eag1-shRNA was shown. Infected with Ad5-Eag1-shRNA inhibited the proliferation and growth of osteosarcoma in vivo and in vitro (allP<0.001). Meanwhile, infected with Ad5-Eag1-shRNA reduced intratumoral MVD and the expression of VEGF (allP<0.001). Moreover, the expression of VEGF (P<0.05), PI3K phosphorylation and AKT phosphorylation (allP<0.001) in osteosarcoma cells were suppressed after infected by Ad5-Eag1-shRNA. Conclusion: Eag1 silencing inhibits tumor proliferation and angiogenesis in osteosarcoma via the down regulation of VEGF/PI3K/AKT signaling.

Ether à go-go 1 Gene; VEGF; Osteosarcoma; Cell Proliferation; Angiogenesis

2016- 05- 17

2016- 08- 05

*國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81402217)

吳 進(jìn)(1983- )，男，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要研究方向：惡性骨腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。

△陳志達(dá)，研究員，E-mail：czd5320@163.com

R738.1；R730.231

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.04.001