張艷海，張大偉，曹　瑩，金　燕*

(1.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上?！?01206；2.黑龍江農墾總醫(yī)院，黑龍江　哈爾濱　150088；

3.上海市獸藥飼料檢測所，上?！?01103)

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在線二維反相色譜法快速測定維生素AD制劑中維生素A、D的含量

張艷海1，張大偉2，曹瑩3，金燕1*

(1.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海201206；2.黑龍江農墾總醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150088；

3.上海市獸藥飼料檢測所，上海201103)

摘要：建立了在線二維液相色譜法快速同時測定維生素AD制劑中維生素A和D的含量。依據(jù)藥典對系統(tǒng)適應性的要求，選擇一種極性嵌合的C18柱(Accucore polar premium)作為二維色譜柱，再依據(jù)疏水減法模型原理和待測樣品的脂溶性特點，選擇C8柱作為一維色譜柱，一維和二維分離均采用甲醇、乙腈和水作為流動相。樣品經(jīng)乙醇提取后直接進樣分析，采用雙梯度液相色譜右泵作為一維分析泵，完成含量較高的維生素A定量及維生素D的凈化；采用左泵作為二維分析泵，維生素D及前維生素D在二維色譜柱上實現(xiàn)分離和定量。根據(jù)維生素D在一維色譜上的出峰起止時間，確定切割時間窗口，以500 μL定量環(huán)收集含有目標物的餾分，檢測波長分別為264 nm和325 nm。采用外標法完成對維生素D和前維生素D的定量。整個過程在密閉系統(tǒng)中自動化完成。維生素A在0.1~250 mg/L，維生素D在0.02~50.0 mg/L范圍內線性關系較好，相關系數(shù)(r)大于0.999；維生素D的回收率為89.9%~98.9%，連續(xù)進樣的精密度和重現(xiàn)性的RSD分別為0.48%和1.2%，表明方法的精密度和重現(xiàn)性較好。

關鍵詞：二維液相色譜；在線分離；維生素D；維生素A；前維生素D；維生素AD滴劑

維生素A(Vitamin A)是指具有與全反式視黃醇(All-trans retinol)同樣生物活性的一類相關化合物，包括視黃醛、視黃酯(維生素A醋酸酯或棕櫚酸酯)[1]，具有促進機體生長、維持表皮完整等功能，是人體必需的營養(yǎng)素之一，其前體主要是存在于多種植物中的胡蘿卜素[2]。在結構上，維生素A類化合物由β-紫羅蘭酮環(huán)連接4個帶有共軛雙鍵的異戊二烯單位構成(見圖1)，因此存在多種順反異構體，其中天然形式為全反式維生素A，其次為13-順式維生素A。維生素D(Vitamin D)屬于甾醇類化合物，除了B環(huán)開環(huán)和A環(huán)3位羥基外，其主體骨架結構與類固醇相似。維生素D主要包括維生素D2(麥角鈣化醇，Ergocalciferol)和維生素D3(膽鈣化醇，Cholecalciferol)兩種同效的維生素，前者較后者在側鏈上多了1個雙鍵和1個甲基(圖1)。人體在280~320 nm的紫外線照射下，皮膚中的7-脫氫膽固醇可轉化成前維生素D，再轉化成維生素D3。維生素D2通常是由植物或酵母菌中的麥角固醇在紫外線所介導的光異構化作用下產生[3]。維生素D的基本作用是促進鈣和磷的吸收，缺乏維生素D，會影響鈣的吸收和骨代謝[4]，最終引起佝僂病、軟骨癥或骨質疏松癥等。

作為藥品的維生素AD制劑在2010版中國藥典和美國藥典35版(USP35)均有收載，其中維生素D受到光熱影響，易產生前維生素D(Pre-vitamin D3)、反式維生素D3(Transvitamin D3)、速甾醇(Tachysterol)和光甾醇(Lumisterol)等，其轉化途徑見圖2。因各異構體結構相近，需要結合正相和反相色譜才能實現(xiàn)各異構體分離[5]。中國藥典附錄維生素D測定法[6]第二法和USP35 <581>[7]維生素D測定法，需要同時對前維生素D和維生素D進行定量，由于前維生素D含量較低，易受基質干擾，因此樣品溶液制備過程通常包括皂化、萃取、反相制備色譜凈化等步驟，最后采用正相色譜紫外檢測法進行分析，整個過程耗時費力，極大影響了分析效率，且目前尚無較好的解決方案。而結合兩種或兩種以上不同分離模式的二維或多維色譜分離在復雜樣品分析中已有較多應用[8-12]。本文首次采用在線二維液相色譜法(2D-LC)，將樣品的凈化及分析過程在線完成，樣品經(jīng)提取后，直接進樣分析，測定了維生素AD藥物制劑中的維生素A、D及前維生素D的含量，提高了方法的準確性和實際樣品的分析效率。

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

三元液相色譜(DGLC)系統(tǒng)(Thermo Fisher，USA)，配置包括6通道真空脫氣機SRD3600、雙梯度分析型色譜泵(DGP3600)、自動進樣器(WPS3000TSL)、二極管陣列檢測器(DAD3000)、柱溫箱(TCC-3000，配1個2位置六通閥和1個2位置10通閥)，變色龍色譜管理軟件(Chromeleon 7.2 SR1)、Acclaim 120 C8色譜柱(150 mm×3.0 mm,3 μm)和Accucore polar premium色譜柱(150 mm×3.0 mm,2.6 μm)。

維生素D3、維生素D2(純度≥95%，HPLC級，中國藥品生物制品檢定所)供含量測定用；全反式維生素A乙酸酯(All-trans retinol acetate，純度>99%，Acros Organics公司)。KOH(分析純)和抗壞血酸(純度≥99.7%，分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)；去離子水(18.2 MΩ·cm)由Millipore純水機制得；維生素AD滴劑市售，維生素AD乳劑由上海市獸藥飼料檢驗所提供。

1.2樣品制備

取維生素AD滴劑內容物適量，精密稱定，置于25 mL 棕色容量瓶中，加適量無水乙醇，超聲(400 W，40 kHz) 處理30 min，冷卻，加無水乙醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。

1.3標準溶液的配制

取適量維生素D3和維生素A標準品，精密稱定，加甲醇溶解并制成濃度分別為0.1 mg/mL和0.5 mg/mL的標準儲備液。

1.4系統(tǒng)適用性溶液制備

取維生素D3標準儲備溶液1.0 mL，置于具塞玻璃容器中，通氮后密封，置于90 ℃水浴中避光加熱1 h，取出迅速冷卻，精密加入甲醇并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，置于1 cm 具塞石英吸收池中，在2 支8 W 主波長分別為254 nm 和365 nm 的紫外燈下，將石英吸收池斜放45°，并距燈管5~6 cm，照射5 min，使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3、維生素D3和速甾醇D3。此溶液為系統(tǒng)適用性試驗用溶液。

1.5儀器條件

DGLC系統(tǒng)的右泵作為一維分析泵，以Acclaim 120 C8柱(150 mm×3.0 mm,3 μm)為一維分析柱，梯度洗脫，流速0.5 mL/min；以DGLC的左泵作為二維分析泵，Accucore polar premium柱(150 mm×3.0 mm,2.6 μm)為二維分析柱，梯度洗脫，流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，流動相均為乙腈(A)、甲醇(B)和水(C)；二極管陣列檢測器的檢測波長分別為264 nm(維生素D)和325 nm(維生素A醋酸酯)；進樣體積5 μL；收集定量環(huán)(Loop環(huán))的體積為500 μL。系統(tǒng)流路連接見圖3，梯度洗脫程序及閥切換時間見表1。

表1　一維分離和二維分離的梯度洗脫程序

*no data

在初始階段，左閥1-6，右閥1-2，一維色譜柱完成維生素A的定量和維生素D的凈化，同時二維色譜柱用初始流動相平衡；在轉移階段，左閥1-6，右閥1-2，一維色譜將含有維生素D及前維生素D的餾分轉移至Loop環(huán)中；在二維分析階段，左閥1-2，右閥1-2，左泵以含有高水的流動相將Loop中的樣品帶入二維色譜柱進行分析，實現(xiàn)維生素D和前維生素D的定量分析。

表2　系統(tǒng)適用性結果

*no data

2結果與討論

2.1系統(tǒng)適應性試驗

2010版藥典二部附錄VD的測定方法[6]中要求維生素D與速甾醇、前維生素D和反式維生素D的分離度大于1.0，維生素D、前維生素D、速甾醇和反式維生素D為同分異構體，分子量均為384.34，用正相色譜法以正己烷-異丙醇或戊醇作為流動相進行分析，能夠將維生素D(VD)、前維生素D(前VD)及其非活性形式分離，但正相色譜法系統(tǒng)平衡慢，且重現(xiàn)性較差；反相色譜法能夠分離維生素D2和D3，但對樣品的前處理要求較高[13]。基于方法耐用性考慮，本文擬采用反相色譜法進行分析。分別嘗試采用Acclaim C8，Acclaim C18，Accucore polar premium(一種極性嵌合的C18柱)，Acclaim C30及Hypersil PAH等色譜柱對系統(tǒng)適應性試驗樣品進行分離。結果顯示，Accucore polar premium色譜柱可實現(xiàn)各異構體基線分離，且各異構體的分離度均大于2，滿足系統(tǒng)適應實驗要求，結果見表2。其中各色譜峰定位的主要依據(jù)為：對比加熱和光照后樣品的色譜圖(圖4)，VD加熱會產生前VD，光照又會產生反式VD和速甾醇，因此可通過對比譜圖定位前VD；參考UV吸收譜圖和相對保留時間，文獻[14]中VD、前VD、反式VD和速甾醇的最大吸收分別為265，265，275，279 nm，本實驗各峰吸收分別為265，262，274.9，281.4 nm，UV吸收和相對保留時間也與文獻報道基本一致；通過LC-MS結果，采用APCI源，結果4個色譜峰的m/z均為385.3[M+H]+，表明各峰的分子量均為384.3。綜上結果實現(xiàn)了對色譜峰的定位。

2.2二維色譜分離方法分析

在前期實驗中已成功構建了嬰幼兒配方奶粉中維生素A、D和E的在線二維色譜分析方法[15]，與奶粉基質樣品不同，維生素AD制劑通過加魚肝油或精煉食用植物油(在0 ℃左右脫去固體脂肪)溶解和調整濃度，并加穩(wěn)定劑適量制成，在儲存和制備過程中會產生前維生素D，其含量甚微，分離及定量易受基質干擾。因此藥典方法通常利用反相制備色譜實現(xiàn)VD(包括前維生素D)與其他基質干擾物的分離凈化，再利用正相色譜對維生素D及其前維生素D進行定量。本文嘗試采用反相色譜凈化結合反相色譜分析的在線二維色譜法對藥品中VA和VD進行同時定量分析，由“2.1”系統(tǒng)適應性試驗結果可知，Accucore polar premium能實現(xiàn)維生素D、前維生素D及其非活性的光熱異構體分離，完全滿足系統(tǒng)適應性試驗要求，可作為第二維的分析柱使用，可對VD和前VD進行定量分析。在第一維凈化色譜柱選擇上,C8柱對脂溶性物質具有較小的疏水作用力，便于將脂溶性較強的基質干擾成分洗脫除去，且C8柱與Accucore polar premium柱分離機理能構成一定的正交性(根據(jù)Snyder等[16]疏水減法模型，兩根色譜柱的正交因子(Fs)為65)，可提升系統(tǒng)分離能力。由圖5～6分離結果可知，前VD3和VD3在第二維色譜柱上實現(xiàn)了基線分離，且峰對稱性良好，完全滿足定量要求。

2.3線性關系、定量下限、精密度與重現(xiàn)性

分別精密量取維生素D3、維生素A的標準儲備溶液適量，配制成系列混合標準溶液，按照優(yōu)化的色譜條件進樣分析。以各目標物的濃度為橫坐標，對應峰面積為縱坐標，做線性回歸。維生素D及維生素A分別在0.02~50.0、0.1~250 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數(shù)(r)均大于0.999。其中維生素D和維生素A的定量下限(S/N=10)分別為0.015 mg/L和0.04 mg/L。

精密度考察采用混合標準溶液連續(xù)進樣6次，測得維生素D、A保留時間的相對標準偏差(RSD)分別為0.07%和0.14%，峰面積的RSD分別為0.48%和0.19%，表明該方法連續(xù)進樣的精密度較好。

取維生素AD滴劑樣品6份，按“1.2”方法制備樣品溶液，測得維生素A和D3在6份樣品中含量的RSD分別為0.58%和1.2%，表明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.4前維生素D校正因子的測定

取濃度為0.1 mg/mL的維生素D儲備液1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成濃度為10 μg/mL的標準品溶液，進樣分析，計算得維生素D的響應因子f1=C1/A1。另精密量取維生素D標準品儲備溶液2份，每份1 mL，置于棕色頂空瓶中，按照2010版藥典二部附錄VD的測定方法[6]測定前VD的響應因子f2=(C1-f1A1)/A2。式中C1為f1測定項下維生素D標準品溶液的濃度(μg/mL)；f1為維生素D的校正因子；A1為混合對照品溶液所得色譜圖中維生素D的峰面積值；A2為混合對照品溶液所得色譜圖中前維生素D的峰面積值。經(jīng)計算得維生素D的響應因子f1為3.37，兩次測定得到前維生素D的響應因子f2的平均值為9.31。

2.5回收率考察

精密稱取維生素AD滴劑樣品3份，分別按照高、中和低3個濃度加入維生素A和D3，渦旋混勻后，按照“1.2”方法制備樣品溶液，在最佳色譜條件下進樣分析，結果見表3。維生素D3的回收率為90.0%~98.9%，平均回收率為93.8%，平均RSD為1.1%，滿足定量要求；維生素A的回收率為106.0%~109.6%，平均回收率為108.1%，平均RSD為0.77%?；厥章式Y果均偏高，分析原因可能為采用本方法的一維反相分離條件未能實現(xiàn)全反式VA和13-順式異構體的拆分所致，但采用本法可完成對VA總量的測定。

表3　維生素AD滴劑中維生素A和D3的加標回收率與相對標準偏差(n=3)

2.6實際樣品的測定

取維生素AD滴劑及乳劑，按照“1.2”方法制備樣品溶液，在最佳色譜條件下進樣分析，計算維生素D 及前維生素D 折算成維生素D 后的總濃度(Ci)：Ci=f1Ai1+f2Ai2。其中Ai1為維生素D的峰面積，Ai2為前維生素D的峰面積。

維生素AD滴劑中維生素A的標示量為1 500 IU/粒(450 μg/粒)，結果測得量為1 722.4 IU/粒(516.73 μg/粒)，滿足藥典標準要求(90%~120%)；維生素D3的標示量為500 IU/粒(12.5 μg/粒)，測得量為604.3 IU/粒(15.11 μg/粒)，也滿足藥典規(guī)定的標準(>85%)；維生素AD乳劑(獸藥)中維生素A的標示量為5 000 IU/g，測得量僅為4 177.33 IU/g；維生素D的標示量為500 IU/g(12.5 μg/g)，而維生素D3的測得量僅為26.12 IU/g(0.65 μg/g)，樣品中主要含維生素D2，其含量以維生素D3計算，約為9.5 μg/g。從測定結果可知，維持AD的含量均不滿足標準要求，作為獸藥維生素AD乳劑，其質量存在一定問題，后期還需要收集大量樣品進行檢測，并與標準方法測定結果進行比較，一方面考察本法的準確性，另一方面可對維生素AD乳劑的整體質量狀況進行評價。

3結論

本文基于在線二維液相色譜技術建立了維生素AD制劑中維生素A和D的測定方法，系統(tǒng)適應性實驗結果表明，本方法可滿足維生素D的測定要求，利用一維色譜柱可完成維生素A總量的測定和維生素D的凈化，利用二維色譜柱可完成維生素D2、維生素D3、前維生素D及其他光化異構體的分離，可準確對藥物中前維生素D和維生素D進行定量分析。本方法的線性關系、準確度和精密度較好，采用優(yōu)化的在線二維系統(tǒng)連接設計，一次進樣可完成維生素A和D的定量測定，大大提高了實際樣品的分析效率，可進行推廣應用。

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Simultaneous Determination of Vitamins A,D in Vitamin A and D Pharmaceutical by Online Two-dimensional Reverse-phase Liquid ChromatographyZHANG Yan-hai1，ZHANG Da-wei2，CAO Ying3，JIN Yan1*

(1.Thermo Fisher Scientific(China) Company,Shanghai201206,China;2.Heilongjiang Agricultural Reclamation

General Hospital,Harbin150088,China；3.Shanghai Animal Disease Control Center，Shanghai201103，China)

Abstract：A rapid method for the simultaneous determination of fat-soluble vitamins A and D in vitamin A and D pharmaceutical was developed using online two-dimensional liquid chromatography(2D-LC).A type of polar embedded C18was selected as the second dimension separating column according to system suitability testing requirement.C8was chosen as first dimension separating column because fat-soluble substance was rich in matrix and a better orthogonality could meet with polar embedded C18according to hydrophobic subtraction model.Sample solution after extracted with methanol without further purification was injected into liquid chromatography directly.The purification of vitamin D and quantification of vitamins A acetate were accomplished simultaneously in one dimensional separation using the right pump of Dual Gradient LC(DGLC) with methanol-acetonitrile-water as mobile phase.Vitamin D and pre-vitamin D were separated and quantified in two dimensional column by using the left pump of DGLC.The eluted target from the first dimensional column(1-D column) was collected by a 500 μL loop and then taken into the second dimensional column(2-D column) by the left pump of DGLC with high aqueous mobile phase.The cutting window could be confirmed by the retention time of target in one dimensional separation.Detection wavelengths of 325 nm and 264 nm were set at the diode-array detector.Vitamin A,vitamin D and pre vitamin D were quantified simultaneously and automatically in one injection by the external standard method.The results showed that the good linearities(r>0.999) for vitamin A and vitamin D could be obtained in the range of 0.1-250 mg/L and 0.02-50.0 mg/L,respectively.The recoveries of vitamin D ranged from 89.9% to 98.9%.The RSDs for precision and reproducibility are 0.48% and 1.2%,respectively.All the validating results indicated that vitamins A and D in pharmaceutical could be quantified rapidly and accurately by this method.

Key words：two-dimensional liquid chromatography(2D-LC)；online separation；vitamin D；vitamin A；pre vitamin D；vitamin A and D drops

中圖分類號：O657.72；O629.4

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)01-0028-07

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.005

通訊作者：*金燕，碩士，高級工程師，研究方向：色譜及色譜-質譜聯(lián)用技術及其應用，Tel：021-69654588，E-mail：jinyanwc@sina.com

收稿日期：2015-06-24；修回日期：2015-07-15