武振興

(秦皇島經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)環(huán)境監(jiān)察大隊, 河北 秦皇島 066000)

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PCR-DGGE技術(shù)在廢水生物處理中的應(yīng)用

武振興

(秦皇島經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)環(huán)境監(jiān)察大隊, 河北 秦皇島 066000)

摘要：變性梯度凝膠電泳( PCR- DGGE)具有可靠性強、重復(fù)性好、方便快捷等優(yōu)點，目前被廣泛地應(yīng)用于廢水生物處理環(huán)境微生物群落多樣性和動態(tài)分析。本文對PCR- DGGE技術(shù)的基本原理和流程，圖譜的優(yōu)化過程和圖譜分析方法，及其在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用進行了綜述，并對該技術(shù)自身存在的局限性和應(yīng)用前景進行了評價。

關(guān)鍵詞：PCR；DGGE；微生物分析

1PCR-DGGE基本原理與方法

1.1PCR-DGGE的基本原理

DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)是由氫鍵和堿基的疏水作用共同作用的結(jié)果。溫度、有機溶劑和pH等因素可以使氫鍵受到破壞，導(dǎo)致雙鏈變性為單鏈。DGGE技術(shù)檢測核酸序列是通過不同序列DNA片段在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度的急劇下降,最后在其相應(yīng)的變性劑梯度位置停滯，經(jīng)過染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分散的條帶。該技術(shù)可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差異，可以用于檢測單一堿基的變化和遺傳多樣性以及PCR擴增DNA片段的多態(tài)性[1]。該技術(shù)首先從復(fù)雜微型生物集合中提取基因組DNA，用特異性引物(如16SrRNA基因和18SrRNA基因)進行PCR擴增，混合的PCR產(chǎn)物在變性劑線性梯度變化的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，相同大小不同序列的DNA 片段將停留在凝膠的不同位置，以達到分離混合PCR產(chǎn)物的目的。

1.2PCR-DGGE的流程

PCR-DGGE的基本流程是(1)首先從各種不同環(huán)境中取得環(huán)境樣品；(2)進行環(huán)境樣品宏基因組DNA的提取及純化；(3)通過聚合酶連鎖反應(yīng)PCR將提取的宏基因組DNA中的特定序列如16SrDNA和18SrDNA進行擴增；(4)進行預(yù)實驗，優(yōu)化DGGE條件；(5)制膠；(6)擴增產(chǎn)物利用DGGE進行分離；(7)DGGE圖譜分析；(8)對DGGE條帶進行測序并鑒定分析；(9)鑒定群落成員。

2PCR-DGGE技術(shù)在廢水生物處理中的應(yīng)用

PCR-DGGE技術(shù)解決了傳統(tǒng)方法的片面性，在分析各種環(huán)境微型生物群落多樣性和動態(tài)性方面得到了廣泛應(yīng)用。于水利等，利用PCR-DGGE方法對3個不同碳源供應(yīng)的反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)以污水為碳源的反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌多樣性要優(yōu)于葡萄糖碳源和乙酸鈉碳源的反應(yīng)器[2]。張丹等采用變性梯度凝膠電泳檢測技術(shù)對硝化菌群的的特異性擴增產(chǎn)物進行了分析，發(fā)現(xiàn)限氧自氧硝化一反硝化生物脫氮系統(tǒng)中氨氧化菌和亞硝酸氧化菌隨溶解氧的降低表現(xiàn)出了不同的種群變化規(guī)律，氨氧化菌種群多樣性受溶解氧的影響非常大，而亞硝酸氧化菌的種群多樣性比較單一，且不受溶解氧的影響[3]。

陳桐生等，以PCR技術(shù)擴增基因的V3可變區(qū)，結(jié)合應(yīng)用雙梯度變性梯度凝膠電泳這一技術(shù)，分析除臭生物濾池中不同空間層次的微生物種群的基因多樣性，及富集前后微生物種群結(jié)構(gòu)的變化，以期了解可培養(yǎng)細(xì)菌的情況，對主要片段進行序列分析。發(fā)現(xiàn)在濾池的不同層次上呈現(xiàn)出明顯的空間分布多樣性差異，并且培養(yǎng)前后及不同培養(yǎng)基富集。培養(yǎng)的微生物種群的多樣性及特異性有很大的差別。序列比對顯示，硫氧化細(xì)菌在除臭過程中占有優(yōu)勢地位[4]。

王曉丹等在對北京翠湖濕地污水塘、 表流濕地和潛流濕地3 個單元的PCRDGGE分析中發(fā)現(xiàn)，北京翠湖表流和潛流濕地改變了水體中總的微生物數(shù)量及可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量，隨著濕地單元的逐級處理,總的微生物數(shù)量呈逐漸上升趨勢，且表流和潛流濕地處理改變了水體中細(xì)菌的優(yōu)勢群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了某些可能對水質(zhì)造成危害的類群[5]。

Moura等采用16S rDNA的DGGE技術(shù)，分析了2個污水處理廠曝氣池中微生物菌群的變化，DGGE圖譜顯示，在春冬和夏秋季節(jié)收集的樣品中，微生物的變化很大，溫度、 pH、 溶解氧(DO)等因素均能影響微生物群落的結(jié)構(gòu)，并進一步確定了所研究樣品中的主要微生物種群[6]。孫寶盛等在實際工程中比較了用膜生物反應(yīng)器( MBR)處理不同水質(zhì)后微生物的DGGE 圖譜，分析了不同MBR中微生物群落多樣性的特點，結(jié)果表明，不同水質(zhì)條件的MBR 在長期穩(wěn)定運行后，形成了各自特定的生態(tài)群落結(jié)構(gòu)，既有共同的優(yōu)勢種群，也有因水質(zhì)的不同經(jīng)過長期演替而產(chǎn)生的各自的種群[7]。張洪軍等在研究A/ O工藝膜生物反應(yīng)器處理生活污水的脫氮特性時，采用了PCR-DGGE技術(shù),發(fā)現(xiàn)隨著系統(tǒng)時間的延長，硝化細(xì)菌的數(shù)量逐漸增加，并且不同菌種的豐度也發(fā)生了變化[8]。

荷蘭Delft大學(xué)Sliekers等[9]應(yīng)用分子生物技術(shù)發(fā)現(xiàn)CANON工藝中可能存在三種微生物：類亞硝化單胞菌的好氧氨氧化菌、類浮霉?fàn)罹膮捬醢毖趸约把趸瘉喯跛猁}的硝化菌和硝化螺菌，并分析了它們在系統(tǒng)中的相互反應(yīng)與競爭關(guān)系。Egli等[10]人則分析了生物膜CANON工藝的生物構(gòu)成和基質(zhì)代謝的途徑。董遠(yuǎn)湘[11]等人用PCR-DGGE技術(shù)對OLAND中硝化階段不同時期的生物膜中微生物的種群動態(tài)變化進行了分析。研究表明，群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢種群的數(shù)量具有時序動態(tài)性，微生物多樣性與廢水的處理效果出現(xiàn)協(xié)同變化的特征。測序結(jié)果表明，在生物膜中進行氨氧化作用的主要為亞硝化桿菌(Nitrosomonas sp.)、亞硝化螺菌(Nitrosospira sp.)；進行亞硝酸氧化的主要為硝化球菌(Nitrococcus sp.)。

3PCR-DGGE方法的局限性

DGGE技術(shù)具有以下缺陷: 1) 其檢測的DNA片段最適長度為500bp，超出此范圍的片段 DGGE分辨率會下降；2) PCR 擴增所需GC堿基對含量至少達40bp；3)如果電泳的條件不適宜，不能保證將有一定序列差異的DNA片段完全分開，會出現(xiàn)序列不同的DNA遷移在同一位置的現(xiàn)象。DGGE的條帶數(shù)不能完全精確地反映被分析的混合物中不同序列的數(shù)量。有時一條DGGE帶可能代表幾種物種，從而導(dǎo)致自然群落中生物的數(shù)量被低估，或者可能不同的幾條DGGE帶代表同一物種，從而導(dǎo)致高估自然群落中生物的數(shù)量；4)數(shù)量較少的物種DNA 可能得不到PCR擴增。

PCR技術(shù)本身也存在不足， 1992年Reysenbach發(fā)現(xiàn)用rDNA基因在PCR過程中會產(chǎn)生優(yōu)先擴增現(xiàn)象，只擴增部分細(xì)菌的DNA，造成了群落中原始成員的減少。另一個問題就是嵌合體的形成或異源雙鏈的產(chǎn)生。它會影響DGGE圖譜中條帶的分布。DGGE只能分離較小的片段(1 kb 以下)，較長的片段分離率下降，這就限制了系統(tǒng)發(fā)育分析和探針的序列信息量。其次，若選用的條件不是特別適宜，DGGE并不能保證可以將有一定序列差異的 DNA 片段完全分開，可能會出現(xiàn)不同序列DNA的共遷移現(xiàn)象。再者，有些細(xì)菌具有多操縱子，使同一種菌的DGGE圖譜上出現(xiàn)多條帶，從而高估了樣品中微生物的多樣性。

4結(jié)論及展望

以 PCR-DGGE 為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展為廢水生物處理新工藝中的微生態(tài)與微生物特性提供了強有力的方法和手段。通過檢測廢水生物處理中微生物種群DNA序列多態(tài)性、鑒定個體基因，就可以在基因水平上評價種群的遺傳分化，并在分子水平上闡述分子適應(yīng)等生態(tài)問題的機制，這對更好地揭示廢水生物處理新技術(shù)中微生物與環(huán)境之間的生態(tài)學(xué)關(guān)系以及為實現(xiàn)新型脫氮工藝系統(tǒng)的優(yōu)化運行具有深刻的理論研究意義與實際應(yīng)用價值。

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文章編號：1671-1602(2016)08-0022-02

作者簡介：武振興(1983-)，男，漢，秦皇島撫寧縣，工程師，本科，單位：秦皇島經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)環(huán)境監(jiān)察大隊，研究方向：環(huán)境保護。