佘平昌，梁春年，裴　杰，禇　敏，郭　憲，閻　萍*

(1.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050)

?

牦牛胎兒皮膚毛囊的形態(tài)發(fā)生及E鈣黏蛋白的表達和定位

佘平昌1，2，梁春年1，2，裴杰1，2，禇敏1，2，郭憲1，2，閻萍1，2*

(1.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050)

摘要：擬研究牦牛毛囊的形態(tài)發(fā)生過程及胎兒毛囊發(fā)生的起始部位，分析E-cadherin(CDH1)對毛囊發(fā)育的作用。采取牦牛胚胎頭部皮膚制備組織切片，觀察毛囊的形態(tài)發(fā)生過程；利用免疫組織化學技術，定位E-cadherin蛋白在毛囊中的表達；使用qRT-PCR方法，比較不同胎齡胎兒頭部皮膚中E-cadherinmRNA轉錄水平。結果表明，毛囊黑色素顆粒在牦牛胎兒皮膚中不同部位先后聚集，牦牛胎兒頭部皮膚在胎齡60～70 d時初級毛囊開始形成毛芽，胎齡130 d時形成毛球結構。次級毛囊在胎齡80～90 d時從初級毛囊中分化出來；并且毛囊的發(fā)育可能最先是從頭部開始的，其中唇部、眉毛、睫毛、角緣發(fā)育最明顯；E-cadherin蛋白定位于頭部皮膚的表皮、真皮及毛囊中，在表皮中表達較高，在毛囊中呈中等陽性表達；E-cadherinmRNA在牦牛不同胎齡皮膚毛囊中相對轉錄水平整體呈上升趨勢，而在90 d時轉錄量較低，顯著低于70、120和130 d時(P<0.05)。牦牛頭部毛囊在60～70 d時開始形成毛芽，毛囊發(fā)育的起始部位可能是從頭部開始的。E-cadherin基因可能參與了牦牛毛囊的發(fā)育。

關鍵詞：牦牛；毛囊；E-cadherin；形態(tài)發(fā)生；qRT-PCR；免疫組織化學

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原及毗鄰山區(qū)的特色寶貴特殊畜種，為牧民提供肉、奶、毛、役力、燃料等生產(chǎn)生活資料，對改善牧民生活水平具有重要的意義。為了適應高寒的生存環(huán)境，牦牛身上的被毛較為厚密，按長短分為短毛和長毛，裙毛為牦牛特有的長毛，可長達50 cm，被廣泛運用于假發(fā)生產(chǎn)；按粗細可分為粗毛和絨毛，能夠提供較好的紡用材料和工業(yè)材料[1]?；诖?，作者對牦牛毛囊的形態(tài)發(fā)生及毛囊發(fā)生的調控因子進行研究，了解牦牛毛囊發(fā)育規(guī)律及相關調控因子，擬為牦牛的分子育種和利用牦牛毛發(fā)資源提供科學依據(jù)。人類的毛囊發(fā)育最先是從頭部開始的[2]，并沿著頭部到臀部這條軸線在電磁效應的推動下波浪式展開[3]。胚胎期毛囊干細胞在上皮細胞、間質和神經(jīng)嵴相互作用下開始分化[4-5]，在早期人類和小鼠的研究中將其劃分為八個階段[6-7]，分為基板前期、基板期、毛芽期、毛釘期、毛囊期幾個時期。很多因子參與了毛囊的形成和發(fā)展，β-catenin、Wnt信號通路具有重要作用[8-9]，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)對皮膚附屬物及細胞的增殖也具有調控作用[10]。E鈣黏蛋白(E-cadherin)是鈣黏蛋白超家族的一員，存在于胚胎和正常組織中，通過介導同種細胞黏附而發(fā)揮作用。其介導的信號途徑主要包括，Wnt信號轉導途徑、Rho-GTP激酶系統(tǒng)及與受體型酪氨酸激酶的互作。E-cadherin對哺乳動物胚胎期上皮的維護和功能具有重要作用，是多細胞上皮發(fā)育的關鍵因素[11]。同時它還參與細胞的維護和轉移，E-cadherin功能的丟失可能導致癌癥的發(fā)生[12]。在毛囊的相關研究中，E-cadherin是毛囊發(fā)育期黑色素形成的關鍵因素之一，其與鈣黏蛋白家族的P-cadherin、H-cadherin 共同完成黑色素細胞與角質細胞的粘連[13]，同時E-cadherin還具有粘連表皮和毛囊并參與毛囊更新的作用[14]。目前對人類、小鼠和羊等的毛囊研究較多[15-18]，而對牦牛毛囊形態(tài)發(fā)生、發(fā)生部位和發(fā)育調控因子的研究很少。作者通過組織切片觀察牦牛毛囊形態(tài)發(fā)生及E-cadherin的表達定位，為探究牦牛毛囊發(fā)育規(guī)律及發(fā)育調控因子提供理論基礎，從而促進牦牛分子育種、品種資源的開發(fā)和保護。

1材料與方法

在國家大通種牛場屠宰場牦牛的屠宰期中采集胎齡各個時期胎兒的額部皮膚樣品，液氮保存，并對其全身進行拍照，測量其頂臀長，根據(jù)胎兒頂臀長與胎齡的線性關系推算胎齡[19]。后期試驗在中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所牦牛繁育工程重點實驗室進行。

1.1毛囊發(fā)育形態(tài)學觀察

皮膚樣品修整至長寬厚1.5 cm×1.5 cm×3 mm大小后，濾紙吸干水分，OCT包埋劑(日本櫻花)包埋，-80 ℃ 30 min。冰凍切片機(萊卡CM1950)25 ℃，10 μm切片。AAF固定液(乙醇85%，冰乙酸5%，甲醛10%)固定5 min，純凈水洗10 s，蘇木素(碧云天)染色5 min，水洗6 min，分化5 s，返藍，梯度乙醇脫水2 min，伊紅(碧云天)染色50 s，梯度乙醇涮洗10 s，顯微鏡(萊卡)觀察。

1.2E-cadherin蛋白的表達定位

冰凍組織切片方法同上，冰凍切片于4 ℃丙酮中固定30 min，3%H2O2甲醇溶液溫室處理30 min，蒸餾水洗滌3次×5 min，滴加5% BSA封閉液，室溫作用20 min后甩去多余液體。滴加兔抗E-cadherin多克隆抗體(博士德產(chǎn)品)，濕盒內4 ℃過夜，PBS沖洗2次，每次3 min，滴加羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min后PBS沖洗5次×3 min，滴加SABC，37 ℃作用20 min后PBS沖洗4次×5 min，DAB顯色，蘇木素復染，觀察，拍照，記錄結果。

1.3E-cadherinmRNA的qRT-PCR

1.3.1RNA的提取及cDNA的合成Trizol法提取不同胎齡牦牛頭部皮膚的總RNA，按照TaKaRa公司試劑盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)說明書合成cDNA。

1.3.2熒光定量PCR參照K.Nganvongpanit等[20]的研究設計E-cadherin基因的上下游引物，F(xiàn)：5′-GTACACCTTCATCGTCCAGAGCTAA-3′，R：5′-GCTCTTCAATGGCTTGTCCATTTGA-3′。根據(jù)GenBank中黃牛GAPDH基因序列(EU195062.1)用Primer Premier 5.0軟件設計上下游引物F：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，R：5′-TCATAAGTCCCTCCACGAT-3′。引物由上海英駿生物公司合成。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

定量PCR(CFX96)反應使用25 μL體系：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 8.5 μL。熒光定量 PCR 的反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)；之后進行熔解曲線分析，程序：65～95 ℃逐漸升溫，每0.5 ℃讀板一次。每個時期三個個體重復，每個樣本重復三次。 反應結束后以熔解曲線來判定qRT-PCR反應的特異性；獲得每個樣品的Ct值，運用2-ΔΔCt法計算相對轉錄水平。

1.4圖像數(shù)據(jù)處理

萊卡顯微鏡觀察，PS圖像標記處理，Excel統(tǒng)計及SAS進行One-way ANOVA分析，用Origin作圖。

2結果

2.1毛囊發(fā)育起始部位的觀察

對于有色毛來說，黑色素的合成只發(fā)生在毛囊形成期，黑色素的多少及分布決定了毛發(fā)的顏色及分布。通過對比發(fā)現(xiàn)，在牦牛胎齡70 d的時候可見眉毛處有黑色素顆粒細胞(MC)的聚集(圖1-A-a)，在胎齡90 d的時候觀察到牦牛的眉毛及睫毛出現(xiàn)MC聚集的情況(圖1-B-a、圖1-B-b)，胎齡105 d時可以明顯的看到胎兒嘴部周圍及額頭有明顯變黑的MC聚集毛囊發(fā)育的跡象(圖1-C)。胎齡140 d時已經(jīng)能夠非常明顯的看到胎兒的頭部已經(jīng)全面有毛囊的發(fā)育(圖1-D)，通過細節(jié)(圖1-E)發(fā)現(xiàn)其中胎兒的下唇部已經(jīng)有毛孔的出現(xiàn)(圖1-E-c)。同時發(fā)現(xiàn)胎兒角部周圍的毛囊聚集特別明顯(圖1-C-e圖1-D-e)，說明牛角的形成可能與周圍毛囊的作用有關系。

2.2毛囊的形態(tài)發(fā)生

毛囊的形成是表皮細胞和真皮細胞之間通過一系列的信號分子來促進細胞群體的增殖分化完成的。通過觀察牦牛額頭皮膚的組織切片發(fā)現(xiàn)，在胎齡55 d之前看到表皮結構較薄，但已經(jīng)形成，沒有出現(xiàn)細胞的聚集(圖2-A)。胎齡60～70 d時，表皮增厚，表皮周圍開始出現(xiàn)大量細胞聚集，開始形成毛芽(圖2-B-c)。胎齡75～80 d時上皮成角質細胞大量增殖，毛芽繼續(xù)向真皮深入，并形成較寬闊的圓柱形(圖2-C)，圓柱形末端形成一個圓形真皮毛乳頭(圖2-C-d)。胎齡80～90 d時毛囊逐漸向真皮深入，變長變粗，已經(jīng)延長成一個實心立體柱狀結構(圖2-D)，由圍繞中心軸排列的多層成角質細胞組成，毛囊側面形成一個膨大部，為次級毛囊原細胞(圖2-D-e)。發(fā)育到胎齡95～105 d時表皮增厚，毛囊頂端與表皮下層形成傘狀連接(圖2-E)，在初級毛囊的側面可以觀察到次級毛囊毛芽的出現(xiàn)(圖2-E-f)。胎齡110～120 d，毛乳頭被毛母質包圍形成近似球形(圖2-F-g)。胎齡130 d時毛囊繼續(xù)發(fā)育，毛乳頭被毛母質包圍(圖2-G-h、i)，形成毛球，同時可見皮脂腺的形成(圖2-G-j)。

次級毛囊的觀察。次級毛囊(SF)是絨毛初始的基本機構，它的發(fā)育相對初級毛囊(PF)晚，SF的變化過程與PF的變化過程基本相同，它的分化是由PF靠近皮膚的一端分化出來的。胎齡85 d時當PF發(fā)育到毛釘期時，毛囊靠近皮膚的一端出現(xiàn)膨大部(圖2-D-e)，這個膨大部就是SF的毛芽，而后和PF以同樣的發(fā)育順序向真皮深入，當胎齡130 d時，SF已經(jīng)發(fā)育形成真皮毛乳頭(圖2-G-f)，隨后繼續(xù)發(fā)育形成完整的毛囊結構。

2.3E-cadherin蛋白的表達定位

為了觀察E-cadherin蛋白的表達位置，選取胎齡120 d毛囊發(fā)育較明顯的皮膚組織做免疫組化試驗。根據(jù)染色程度，可將 E-cadherin染色結果分為 4 個等級：陰性：無著色；弱陽性：染色弱，呈淡黃色；中等陽性：中等染色，呈黃褐色；強陽性：染色強，呈棕褐色。結果顯示，E-cadherin在毛囊、表皮及真皮層中都有表達(圖3-B、C)。E-cadherin在皮下組織無著色為陰性(圖3-B-c)，毛囊中E-cadherin陽性產(chǎn)物呈黃褐色(圖3-B-b)，為中等陽性，而毛囊中的毛球部位比毛球以上的毛囊部位具有更多的陽性產(chǎn)物。而在真皮層部分呈淡黃色(圖3-B-d)，為弱陽性。在皮膚的表皮層有較多的陽性產(chǎn)物的存在，呈現(xiàn)棕褐色(圖3-C-a)，為強陽性。

2.4不同時期E-cadherinmRNA轉錄水平變化

為了觀察E-cadherinmRNA在毛囊發(fā)育各個時期的相對轉錄水平，選擇了胎齡70、90、120和130 d樣本做熒光定量試驗。半定量RT-PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)E-cadherinmRNA在頭部皮膚中有表達。熔解曲線分析發(fā)現(xiàn)，E-cadherin基因的PCR產(chǎn)物均呈較為銳利的單一峰(圖4-B)，排除了形成引物二聚體和非特異性產(chǎn)物對結果帶來影響的可能，同時說明引物有很好的特異性。通過擴增曲線可知，E-cadherin基因及GADPH內參的擴增效果較好，內參最先達到熒光閾值(圖4-A)。檢測結果發(fā)現(xiàn)，E-cadherinmRNA在牦牛頭部皮膚的相對轉錄量整體呈上升趨勢(圖5)，而在胎齡90 d時轉錄量最低，顯著低于70、120和130 d(P<0.05)，極顯著低于130 d(P<0.01)；胎齡70 d轉錄量也較低，顯著低于130 d(P<0.05)。

3討論

關于毛囊發(fā)育部位順序的研究發(fā)現(xiàn)，牦牛毛囊的發(fā)育首先是從頭部開始的，其中以下唇部、眉毛、睫毛、角緣發(fā)育最明顯。對于有色毛發(fā)來說，黑色素合成只發(fā)生于毛囊生長期，毛球部的黑色素細胞合成黑色素顆粒，轉運到毛干皮質細胞。黑色素顆粒的多少、顆粒性狀以及分布決定毛發(fā)的顏色[21]。K.A.Holbrook等[2]在人類的研究中發(fā)現(xiàn)，人類的毛囊發(fā)育始于頭部，最先從眉毛、睫毛及下唇緣開始逐漸擴展到整個胚胎。在這一點上牦牛和人類是類似的。但是為什么毛囊的發(fā)育是從頭部開始的，又是怎么從頭部開始的呢？毛囊的發(fā)育沿著頭部到臀部這條軸線展開[3]，頭部的毛囊在基底細胞的誘導下形成并極化形成電磁感應現(xiàn)象，推動毛囊發(fā)育波浪式展開。毛囊發(fā)育部位的研究對于探索毛囊發(fā)育規(guī)律及動物毛發(fā)資源的利用都具有很大的意義，本研究中通過觀察有色毛囊黑色素顆粒的聚集形式來觀察毛囊發(fā)育順序，但是這種觀察方法是有局限性的不能準確定位各部位發(fā)育的先后。

關于毛囊的形態(tài)發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn)，牦牛胚胎額頭皮膚毛囊在胎齡60～70 d的時候開始發(fā)育，胎齡130 d時發(fā)育形成毛球結構，次級毛囊在胎齡80～90 d時從初級毛囊中分化出來。動物毛囊的發(fā)育是由胚胎干細胞在經(jīng)歷一系列刺激的作用下分化完成的[4，22]，根據(jù)小鼠模型可分為基板期、毛芽期、毛釘期及毛囊期幾個時期[23]。在草食動物中，M.H.Hardy等[24]在1955年對綿羊的毛囊發(fā)育做了系統(tǒng)的分析。本研究中，牦牛的額頭皮膚在胎齡55 d前觀察不到毛囊發(fā)育的跡象，此階段可能是毛囊發(fā)育的準備期，細胞接受相關刺激朝著一定的方向進化。胎齡60～70 d時，毛芽開始出現(xiàn)，與內蒙古的絨山羊相比要晚[25]，這可能與物種的差異性、妊娠期及動物的耐低溫都有一定的關系。而后毛芽繼續(xù)發(fā)育在胎齡130 d時已經(jīng)基本形成完整的毛囊結構。次級毛囊的發(fā)育在初級毛囊毛釘時期開始，次級毛囊是牦牛等耐寒動物御寒的基礎，也是產(chǎn)毛量多少的基礎。次級毛囊的形成是在初級毛囊的一側支生出來的，時期大約在胎齡85 d左右。本研究發(fā)現(xiàn)頭部的毛囊毛芽是從胎齡60～70 d的時候開始的，說明牦牛毛囊的發(fā)育比較早，而軀干及四肢毛囊的發(fā)育可能會比額頭要晚5～20 d，而形成這一差異的調控因子需進行深入研究。

關于E-cadherin蛋白表達和定位的研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin表達于牦牛額頭皮膚毛囊中的表皮、真皮及毛囊中，在真皮中表達較弱，而在表皮及毛囊中表達較高。E-cadherinmRNA在牦牛頭部皮膚的相對轉錄水平整體呈上升趨勢，而在90 d時轉錄量較低，顯著低于70、120和130 d(P<0.05)，極顯著低于130 d(P<0.01)；胎齡70 d轉錄量也較低，顯著低于130 d(P<0.05)。鈣黏蛋白超家族是一種鈣離子依賴性跨膜糖蛋白。通過介導同種細胞間發(fā)生黏附而發(fā)揮作用。存在于胚胎組織和正常組織的上皮細胞中。鈣黏蛋白(E-cadherin)主要通過三條介導信號通路：一是Wnt信號轉導途徑，主要是通過Beta-catenin的作用；二是Rho-GTP激酶系統(tǒng)通過Rho蛋白的競爭來調節(jié)E-cadherin的黏附活力；三是通過與受體型酪氨酸激酶的作用來調節(jié)細胞黏附，E-cadherin對毛囊黑色素形成、毛囊與表皮的黏附都具有重要作用[11-14]。J.Kishimoto等[26]發(fā)現(xiàn)E-cadherin通過Wnt信號通路對哺乳動物胚胎期毛囊的發(fā)育具有調控作用。同時E-cadherin可以促進細胞間的黏附聚集以及維持細胞極性、上皮細胞結構的完整性，并參與細胞發(fā)育調節(jié)組織的發(fā)育及形成，抑制細胞遷移，維護正常細胞間的選接和極性，而且對細胞發(fā)育、生長、腫瘤轉移、細胞運動起主要作用，這可能是導致E-cadherin在表皮中較高表達的原因。S.Müller-R?ver等[27]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠脫毛后毛發(fā)再生的過程中E-cadherin基因轉錄量較低，推測E-cadherin基因對毛囊發(fā)育具有負調節(jié)作用；本研究中在胎齡90 d時E-cadherin基因轉錄量顯著低于70、120和130 d，可能是E-cadherin基因對毛囊發(fā)育具有調節(jié)作用。K.Nganvongpanit等[20]發(fā)現(xiàn)E-cadherin在黃牛的毛囊發(fā)育中有表達，D.L.Gay等[28]也在人類的毛囊中發(fā)現(xiàn)了它的表達，同時它又是一種信號轉導因子[29]；毛囊的發(fā)育是由上皮細胞及位于下層的間充質細胞相互作用刺激分化的，同時E-cadherin又在細胞黏附及黑色素生成中具有重要作用。由此推測，E-cadherin可能參與牦牛毛囊的發(fā)育。

4結論

牦牛胎兒頭部皮膚在胎齡60～70 d時毛囊開始形成毛芽，胎齡130 d時形成毛球結構，次級毛囊在胎齡80～90 d時從初級毛囊中分化出來。毛囊的發(fā)育可能是從頭部開始的。E-cadherin蛋白表達于牦牛額頭皮膚毛囊中的表皮、真皮及毛囊中，在表皮中表達較高，在毛囊中呈中等陽性表達。E-cadherinmRNA在牦牛頭部皮膚的轉錄水平整體呈上升趨勢，而在90 d時轉錄量較低，顯著低于70、120和130 d。推測E-cadherin基因可能參與了牦牛毛囊的發(fā)育。

參考文獻(References)：

[1]張容昶.中國的牦牛[M].蘭州：甘肅科學技術出版社，1989.

ZHANG R C.China：The yak[M].Lanzhou：Gansu Science and Technology Publishing House，1989.(in Chinese)

[2]HOLBROOK K A，MINAMI S I.Hair follicle embryogenesis in the human.Characterization of eventsinvivoandinvitro[J].AnnNYAcadSci，1991，642：167-196.

[3]DEVENPORT D，F(xiàn)UCHS E.Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles[J].NatCellBiol，2008，10(11)：1257-1268.

[4]CHRISTIANO A M.Epithelial stem cells：stepping out of their niche[J].Cell，2004，118(5)：530-532.

[5]SIEBER-BLUM M，GRIM M，HU Y F，et al.Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle[J].DevDyn，2004，231(2)：258-269.

[6]MCELWEE K，HOFFMANN R.Growth factors in early hair follicle morphogenesis[J].EurJDermatol，2000，10(5)：341-350.

[7]PAUS R，MüLLER-R?VER S，VAD DER VEEN C，et al.A comprehensive guide for the recognition and classification of distinct stages of hair follicle morphogenesis[J].JInvestDermatol，1999，113(4)：523-532.[8]MOU C，JACKSON B，SCHNEIDER P，et al.Generation of the primary hair follicle pattern[J].ProcNatlAcadSciUSA，2006，103(24)：9075-9080.

[9]ANDL T，REDDY S，GADDAPARA T，et al.WNT signals are required for the initiation of hair follicle development[J].DevCell，2002，2(5)：643-653.

[10]BOTCHKAREV V A，KISHIMOTO J.Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling[J].JInvestigDermatolSympProc，2003，8(1)：46-55.

[11]LARUE L，OHSUGI M，HIRCHENHAIN J，et al.E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium[J].ProcNatlAcadSciUSA，1994，91(17)：8263-8267.

[12]PERL A K，WILGENBUS P，DAHL U，et al.A causal role for E-cadherin in the transition from adenoma to carcinoma[J].Nature，1998，392(6672)：190-193.

[13]KUPHAL S，BOSSERHOFF A K.E-cadherin cell-cell communication in melanogenesis and during development of malignant melanoma[J].ArchBiochemBiophys，2012，524(1)：43-47.

[14]YOUNG P，BOUSSADIA O，HALFTER H，et al.E-cadherin controls adherens junctions in the epidermis and the renewal of hair follicles[J].EMBOJ，2003，22(21)：5723-5733.

[15]SCHMIDT-ULLRICH R，PAUS R.Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis[J].Bioessays，2005，27(3)：247-261.

[16]NOWAK J A，POLAK L，PASOLLI H A，et al.Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis[J].CellStemCell，2008，3(1)：33-43.

[17]ADELSON D L，CAM G R，DESILVA U，et al.Gene expression in sheep skin and wool (hair)[J].Genomics，2004，83(1)：95-105.

[18]GAT U，DASGUPTA R，DEGENSTEIN L，et al.De novo hair follicle morphogenesis and hair tumors in mice expressing a truncated β-catenin in skin[J].Cell，1998，95(5)：605-614.

[19]LIU B，CUI Y，YANG B，et al.Morphometric analysis of yak placentomes during gestation[J].AnatRec(Hoboken)，2010，293(11)：1873-1879.

[20]NGANVONGPANIT K，MüLLER H，RINGS F，et al.Targeted suppression of E-cadherin gene expression in bovine preimplantation embryo by RNA interference technology using double-stranded RNA[J].MolReprodDev，2006，73(2)：153-163.

[21]SLOMINSKI A，TOBIN D J，SHIBAHARA S，et al.Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation[J].PhysiolRev，2004，84(4)：1155-1228.

[22]MATSUZAKI T，YOSHIZATO K.Role of hair papilla cells on induction and regeneration processes of hair follicles[J].WoundRepairRegen，1998，6(6)：524-530.[23]PAUS R，COTSARELIS G.The biology of hair follicles[J].NEnglJMed，1999，341(7)：491-497.

[24]HARDY M H，LYNE A G.The pre-natal development of wool follicles in Merino sheep[J].AustJBiolSci，1956，9(3)：423-441.

[25]張燕軍，尹俊，李長青，等.內蒙古阿爾巴斯絨山羊胎兒期皮膚毛囊發(fā)生發(fā)育規(guī)律研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2006，37(8)：761-768.ZHANG Y J，YIN J，LI C Q，et al.Study on development of skin and hair follicle from fetal Inner Mongolian Arbas cashmere goats[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2006，37(8)：761-768.(in Chinese)[26]KISHIMOTO J，BURGESON R E，MORGAN B A.Wnt signaling maintains the hair-inducing activity of the dermal papilla[J].GenesDev，2000，14(10)：1181-1185.[27]MüLLER-R?VER S，TOKURA Y，WELKER P，et al.E-and P-cadherin expression during murine hair follicle morphogenesis and cycling[J].ExpDermatol，1999，8(4)：237-246.

[28]GAY D L，YANG C C，PLIKUS M V，et al.CD133 expression correlates with membrane beta-catenin and E-cadherin loss from human hair follicle placodes during morphogenesis[J].JInvestDermatol，2015，135(1)：45-55.

[29]JAMORA C，DASGUPTA R，KOCIENIEWSKI P，et al.Links between signal transduction，transcription and adhesion in epithelial bud development[J].Nature，2003，422(6929)：317-322.

(編輯白永平)

Fetal Skin Hair Follicle Morphogenesis and E-Cadherin Expression of the Yak

SHE Ping-chang1，2，LIANG Chun-nian1，2，PEI Jie1，2，CHU Min1，2，GUO Xian1，2，YAN Ping1，2*

(1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalSciencesofCAAS，Lanzhou730050，China；2.KeyLaboratoryofYakBreedingEngineeringofGansuProvince，Lanzhou730050，China)

Key words:yak；hair follicle；E-cadherin；morphogenesis；qRT-PCR；immunohistochemistry

Abstract:The objective of this study was to observe yak hair follicle morphogenesis and fetal hair follicle original sites，study the importance of E-cadherin (CDH1) in the development of hair follicles.Skin tissue sections of the Yak embryo head were observed，and the hair follicle morphogenesis was studied.The melanin granules of fetal skin at different month and the development of hair follicle original sites were detected.The expression of E-cadherin protein was analyzed by using immunohistochemistry.The mRNA transcription levels ofE-cadheringene in different month fetal head skin was tested by using qRT-PCR method.Results showed that the fetal head skin begins to form primary hair buds in embryonic age of 60-70 days，and form the hair bulbs structure in the embryonic age of 130 days.Secondary hair follicles differentiate out from primary hair follicles in gestational age of 80-90 days；The parts of the fetal skin melanin gathering situations in different periods were observed，the hair follicles differentiation was started from head，of which lower，eyebrows，eyelashes，and horn site were the most obvious；E-cadherin protein was located on the epidermis，dermis and hair follicles，and showed high expression in epidermis，and moderate positive expression in hair follicles.E-cadheringene mRNA transcription were uptrend in different embryonic age of yak skin hair follicle，but was lower at the embryonic age of 90 days，it was obviously below those at 70 days，120 days and 130 days (P<0.05).Yak head hair follicle is developed in the embryonic age of 60-70 days to form hair buds，and hair follicle development is likely forms from head.E-cadheringene is most likely involved in the development of yak hair follicles.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.025

收稿日期：2015-05-13

基金項目：牦牛遺傳資源與育種(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-01)；科技部科技支撐計劃(2012BAD13B05)

作者簡介：佘平昌(1989-)，男，云南普洱人，碩士生，主要從事家畜分子生物學研究，E-mail：sheemail@163.com *通信作者：閻萍，研究員，博士生導師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：pingyanlz@163.com

中圖分類號：S852.1

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0397-07