冉丹丹，周　芳，黃志宏，湯　承，劉亞剛

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

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牦牛源鮑氏志賀菌人工感染BALB/c小鼠的組織病理學觀察

冉丹丹，周芳，黃志宏，湯承*，劉亞剛

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

摘要：為了解牦牛源鮑氏志賀菌對實驗動物除腸道外的心、肝等的快速致病性損傷，本研究以牦牛源鮑氏志賀菌感染SPF小鼠，劑量為0.5 mL·只-1(2×109CFU·mL-1)，感染后6、18、30、42、54、66 h剖殺、取樣并對剖解進行詳細觀察，在每個安排的時間點平行采集3只小鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸和胰腺等組織，制備組織切片，通過HE染色和免疫組化染色，對感染小鼠的組織病理學變化和細菌定位進行觀察，收集小鼠血液進行乳酸脫氫酶、尿素、肌酐、α-淀粉酶、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、磷酸激酶、CO2結合力、P、血糖、白細胞數(shù)等血液生化指標檢測。試驗結果表明，小鼠除小腸上皮細胞損傷外，心外膜下出現(xiàn)凝固性壞死病灶，肝組織有炎性細胞浸潤及肉芽腫形成，肺泡壁炎性細胞浸潤，胰腺上皮細胞腫脹，細胞質溶解，細胞核固縮或碎裂等；心肌細胞、肝細胞、肺泡壁、腎小管細胞、胰島細胞、腸上皮細胞細胞質內(nèi)均有待檢菌體抗原陽性反應；生化指標除甘油三酯外均有一定變化。試驗證實病變的嚴重程度與菌體抗原檢出量成正相關，分離株能在實驗動物體內(nèi)進行大面積侵嗜，心、肝、肺、胰腺、腎也是牦牛源鮑氏志賀菌分離株的主要靶器官。生化指標和病理損傷的特征性變化對該病診斷與研究拓展具有重要價值。

關鍵詞：牦牛源鮑氏志賀菌；病理觀察；抗原分布

志賀菌屬(Shigella)是具有高度傳染性和嚴重危害性的革蘭陰性胞內(nèi)致病菌，與沙門菌、金黃色葡萄球菌一并認為是導致全球范圍內(nèi)大量人畜死亡的食源性疾病病原菌[1-3]。根據(jù)現(xiàn)有文獻，志賀菌的相關病理研究主要針對其對腸道的致病性[4-5]，也有感染肺致病的報道[6]，M.M.Islam等[7]證實志賀菌可引起人的包括敗血癥、低血鈉、低血鉀和低血糖等生化指標異常。筆者在2011年首次分離獲得一株牦牛源鮑氏志賀菌[8]，在研究其毒力過程中發(fā)現(xiàn)該分離株對除腸道以外的機體臟器存在致病性，可導致試驗動物肝炎癥，心房外壁出現(xiàn)白色病灶等，重復試驗均可出現(xiàn)相應病變，具有一定特點。為深入研究該分離株在機體組織、器官的動態(tài)分布及致病機制，進行了實驗動物人工感染、常規(guī)組織病理學檢查、免疫酶組織化學染色和生化指標檢測。本研究針對牦牛源鮑氏志賀菌分離株建立實驗病理模型，針對分離株感染實驗小鼠出現(xiàn)的臨床癥狀、部分生化指標變化、病理變化和細菌抗原定位進行系統(tǒng)研究，以期了解該菌株的致病機制，為更好地防控人畜志賀菌病和深入拓展相關研究提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株和實驗動物

牦牛源鮑氏志賀菌，由西南民族大學動物醫(yī)學四川省重點實驗室保存；4周齡SPF級BALB/c小鼠，26只，雌雄各半，購自四川省成都達碩生物科技有限公司。

1.2實驗器材

兔抗鮑氏志賀菌多克隆IgG抗體(bs-4583R，Beijing biosynthesis bitechnology Co.，Ltd，China)；過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒SP-9001(SP-9001 HistostainTM-Plus Kits，)；DAB顯色試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；石蠟組織切片機，美國Leica公司；ECLIPSE 6200顯微鏡，日本Nikon公司；4%多聚甲醛溶液、LB試劑、微量加樣器及配套槍頭、1 mL無菌注射器、消毒灌胃針等。

1.3人工感染實驗動物

4周齡BALB/c小鼠購回后正常飼喂觀察2 d。將26只BALB/c小鼠隨機分為2組，其中試驗組22只，對照組4只。先觀察3 d無異常后再進行人工感染試驗。根據(jù)預試驗結果，用分離株0.5 mL(2×109CFU·mL-1)[8]灌胃進行人工感染試驗，對照組灌胃生理鹽水。以出現(xiàn)嗜睡、精神萎靡、被毛聳立為感染成功發(fā)病指標，感染后6、18、30、42、54、66 h剖殺、取樣并對剖解變化進行詳細觀察，在每個安排的時間點平行采集3只小鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸和胰腺等組織固定于4%多聚甲醛，常規(guī)制作石蠟切片(4 μm)。收集小鼠血液進行乳酸脫氫酶(LDH)、尿素、肌酐、α-淀粉酶、甘油三酯(TG)、總蛋白、白蛋白、磷酸激酶、CO2結合力、P、血糖、白細胞數(shù)等血液生化指標檢測。

1.4病理組織切片HE染色和免疫酶組織化學染色

小鼠組織切片進行HE染色和免疫酶組織化學染色。HE染色按常規(guī)方法進行。免疫組化一抗采用兔抗鮑氏志賀菌多克隆IgG抗體(bs-4583R)，免疫組織化學染色按過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒說明書進行。染色操作步驟大致如下：石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2浸泡，避光20 min后蒸餾水沖洗3 min×3次；枸櫞酸緩沖鹽(pH6.0)高壓修復3 min，PBS沖洗5 min×2次；1∶20羊血清封閉37 ℃ 30 min；甩去多余血清，加一抗37 ℃ 1～2 h，PBS沖洗，5 min×2次；1∶200二抗37 ℃ 40 min，PBS沖洗，5 min×2次；SP(1∶200)37 ℃ 30 min，PBS沖洗，5 min×2次；3，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色，鏡下控制顯色時間，自來水中止顯色；自來水充分沖洗，復染，封片；陰性對照以PBS代替一抗。

染色切片置于Nikon ECLIPSE 6200顯微數(shù)碼圖像采集系統(tǒng)上采集圖像，用ImagePro-Plus6.0圖像分析軟件測量其陽性顆粒累積光密度值(IOD)，所得數(shù)據(jù)用Excel表格進行統(tǒng)計處理，分別計算各時間點各組織臟器的平均累積光密度值，并繪制陽性累積光密度值動態(tài)柱形圖。

2結果

2.1志賀菌人工感染BALB/c小鼠模型的建立

接菌后2 h小鼠出現(xiàn)嗜睡、精神萎靡、被毛聳立等臨床癥狀，36 h有一只試驗組小鼠死亡，48 h后小鼠精神恢復。觀察期內(nèi)對照組小鼠精神均正常，未出現(xiàn)死亡。經(jīng)剖檢，試驗組小鼠于感染后18 h即可見小腸內(nèi)充盈黃色透亮內(nèi)容物，感染后6 h即可見小鼠心外膜下有細小白色病灶，且隨時間點的延長病灶擴大和融合(圖1)。

2.2志賀菌人工感染BALB/c小鼠后主要血液生化指標

小鼠血液生化指標檢測結果除甘油三酯外，乳酸脫氫酶、尿素、肌酐、α-淀粉酶、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、磷酸激酶、CO2結合力、P、血糖、白細胞數(shù)等指標均有一定的變化。其中，血清總蛋白、CO2結合力、乳酸脫氫酶水平先降低后升高，尿素、肌酐、白蛋白、白細胞數(shù)水平總體上呈降低趨勢，血糖、磷酸激酶、α-淀粉酶水平先升高后降低，P水平總體升高。變化趨勢曲線見圖2。其中，由于各項指標數(shù)值和單位相差較大，為了在同一個圖中展示做了相應處理，處理方法見生化指標名稱后。

2.3病理組織學檢查

小鼠組織切片HE染色觀察，感染小鼠除脾、大腸未見明顯病理變化外，其余臟器均出現(xiàn)不同程度病理變化(圖3)。其中，小鼠心組織切片可見各時間點心肌組織充血，心腔內(nèi)有多少不一血凝塊，6、30、42、54 h可見心外膜下有壞死和炎癥細胞增生浸潤病灶，且隨時間的延長而增大；肝組織切片各時間點均見不同程度充血，54、66 h偶見凝固性壞死灶，少量散在巨噬細胞與淋巴細胞浸潤病灶，18、30、54 h可見肝細胞內(nèi)出現(xiàn)細小空泡；肺組織切片可見隨感染時間的延長，肺泡壁細胞增多，肺泡壁增寬，肺泡腔狹窄或消失。42、54 h可見血管周圍或支氣管旁有灶性或散在的巨噬細胞與淋巴細胞等炎癥細胞浸潤；腎組織切片可見感染組小鼠腎間質均充血，6、18 h可見腎小管上皮細胞腫脹，細胞質內(nèi)出現(xiàn)小空泡；胰組織切片42、54 h可見胰腺上皮細胞腫脹，漿細胞質溶解，遺留少量絲網(wǎng)狀紅染物，細胞核固縮或已碎裂、溶解；小腸組織切片于2、66 h可見小腸絨毛頂端凝固性壞死，組織細胞結構破壞，遺留紅染無細胞結構碎片；大腦組織切片可見感染小鼠均出現(xiàn)腦膜充血。

2.4免疫組織化學檢查

免疫組化染色見鮑氏志賀菌感染小鼠的心、肝、肺、腎、小腸、大腸、胰腺共7個器官組織細胞的細胞質出現(xiàn)黃色陽性顆粒。鮑氏志賀菌抗原最早于感染后6 h的小鼠心、肝、肺、腎、小腸、大腸、胰島等臟器組織細胞質中檢出。除小腸上皮細胞、大腸上皮細胞、胰島細胞隨感染時間的延長表達量有所降低外，其余組織器官的細菌抗原檢出量隨感染時間的持續(xù)進一步增多。各組織中的細菌抗原含量以肺和胰島最高，其余組織器官次之。各組織器官的免疫組化結果見圖4，圖5。

3討論

3.1分離株致病特性

腸道致病菌是導致發(fā)展中國家嬰兒和五歲以下兒童、年長和免疫功能不全人群發(fā)病、死亡的主要原因[9]。人和靈長類是志賀菌的適宜宿主，根據(jù)宿主的健康狀況和年齡，只需10個細菌細胞就可致病，其強致病性使其成為重要的食源性腸道致病菌[10]。本文中的分離株分離自高海拔川西北草地外表健康牦牛體內(nèi)。志賀菌血清型和種的確定對于疾病的預防和治療極為重要，而福氏志賀菌被認為是亞洲地區(qū)的優(yōu)勢血清型[11]，高原生態(tài)環(huán)境特殊，病原微生物交流有限，通常認為病原菌血清型較為單一。但本次牦牛源鮑氏志賀菌的分離和其致病性試驗，提示在高原地區(qū)人畜志賀菌病的防治過程中，混合血清型的交互影響增強病原菌對宿主的致病性現(xiàn)象不容忽視。在高原人畜志賀菌病的防治中不能僅僅是按照單一的優(yōu)勢血清型進行。

作為典型的腸道致病菌，對腸道的致病性研究是重點，目前針對志賀菌感染腸道的免疫應答、致病作用、致病機制以及相應分子生物學研究較為成熟，常采用恒河猴、小鼠、大鼠等實驗動物或腸上皮細胞培養(yǎng)等離體試驗觀察[12-13]。本次試驗在此基礎上同時也關注分離株在實驗動物體內(nèi)多個臟器的動態(tài)分布和致病損傷。在本次試驗中，細菌抗原廣泛分布于除腦組織以外的各個臟器中。細菌抗原在6 h的心、肝、肺等組織中被檢出，通過免疫酶組織化學染色觀察，細菌抗原不僅存在于組織病灶位置的細胞質內(nèi)，同時也廣泛存在于心肌細胞細胞質、肝細胞細胞質、腎小管上皮細胞和腸上皮細胞。這一結果證實了鮑氏志賀菌是一種胞內(nèi)致病菌，與師潤等[5]利用免疫組化方法定位細菌于腸上皮細胞的報道相符。在病理切片上觀察到的心外膜下壞死和炎癥細胞增生浸潤病灶、肝凝固性壞死灶、肺泡內(nèi)炎性細胞浸潤、胰腺上皮細胞核固縮等病變現(xiàn)象更說明本分離株是一株廣泛侵嗜性致病菌，提示在志賀菌病癥的治療中也應考慮其對多個臟器的影響。為后續(xù)相關志賀菌病研究奠定基礎。

3.2致病機制

志賀菌致病的關鍵是侵蝕和定殖腸上皮細胞。通過利用濾泡相關上皮中的M細胞通過腸道上皮壁壘屏障，隨后進入腸道基底組織，從基底外膜表面侵入腸上皮細胞。在濾泡相關上皮細胞下的圓形淋巴組織區(qū)域被巨噬細胞等炎性細胞所吞噬。細菌被吞噬后會啟動巨噬細胞的細胞凋亡模式致使細胞死亡。被感染的巨噬細胞在死亡之前會釋放促炎性細胞因子白介素IL-1β和IL-18通過IpaB侵襲素激活細胞蛋白凋亡酶-1。這些細胞因子聯(lián)合如IL-8之類的趨化因子，擴充了中性粒細胞數(shù)，侵入感染位點，使上皮細胞的防御壁壘更為薄弱。其直接結果是摧毀了腸上皮細胞的防御屏障，使更多的細菌進入到上皮下的空間，入侵腸上皮細胞，最終遍布所有腸上皮細胞[14-15]。結合實驗動物血清多個生化指標檢測結果，證實細菌在腸道的分布過程中侵入血管，隨血液移行至體內(nèi)多個臟器。其中，在肝、心這兩個血液流通量較大的器官集中發(fā)揮其免疫損傷作用。生化指標的檢測表現(xiàn)一定的特征性，為疾病診斷提供參考。以肝組織病變?yōu)槔毦高^血管壁進入肝細胞，干擾細胞內(nèi)粗面內(nèi)質網(wǎng)的作用以影響肝細胞蛋白質的合成作用。肝細胞在外因素干擾作用下發(fā)生的細胞凋亡和細胞壞死可分別在數(shù)小時和數(shù)天內(nèi)表現(xiàn)[16]，與本試驗中肝細胞壞死灶首先出現(xiàn)時間54 h大致相符。肝細胞損傷或壞死后，向血液中釋入大量LDH，致使血中LDH值升高[17]，如本試驗中隨著時間的延長，LDH總體增高趨勢持續(xù)。肝出現(xiàn)病理損傷，在日常診斷中僅能依靠相關血液生化指標改變進行判定。類似的生化指標與病理損傷對應呈現(xiàn)同樣出現(xiàn)在肺和CO2結合力、胰腺和血糖等。將生化指標、病理損傷和致病機制聯(lián)系在一起，對相應生化指標的持續(xù)性監(jiān)控，一方面可對臟器損傷程度進行預測，另一方面可對疾病診斷提供參考，同時引出人志賀菌病診斷試劑盒研究新選項。

4結論

牦牛源鮑氏志賀菌分離株能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生快速致病性損傷，導致除腸道、肺等已知臟器以外臟器(如心、胰腺、腎)的病變。通過免疫組化染色檢測，細菌抗原不僅存在于組織病灶位置的細胞質內(nèi)，同時也廣泛存在于心肌細胞細胞質、肝細胞細胞質、腎小管上皮細胞和腸上皮細胞。對應臟器生化指標的改變提示可作為志賀菌病程診斷的重要依據(jù)。

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(編輯白永平)

Histopathological Observation in BALB/c Mice Experimentally Infected withShigellaboydiifrom Yak

RAN Dan-dan，ZHOU Fang，HUANG Zhi-hong，TANG Cheng*，LIU Ya-gang

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

Key words:Shigellaboydiifrom Yak；pathological observation；antigen distribution

Abstract:The objective of this study was to research the fast pathogenic damage ofShigellaboydiifrom yak in BALB/c mice organs except intestine.The 4-week-old mouse were given 0.5 mL ofShigellaboydiiisolate(2×109CFU·mL-1)by gavage.Tissue samples of cerebrum，heart，liver，spleen，lung，kidney，intestine and pancreas were taken from the infected mouse after being infected for 6，18，30，42，54 and 66 h，and ever since for every 12 hours to make tissue biopsies，which were then stained with haematoxylin and eosin (H.E) and immunohistochemistry to observe the changes of histopathology and the bacterial antigen localization in experimentally infected ducklings.Mouse serum were collected for biochemical indicators detection including lactate dehydrogenase，urea，creatinine，α amylase，triglyceride，total protein，albumin，phosphokinase，CO2binding force，P，blood glucose and white blood cell count.The HE staining results showed a series of pathologic changes，not only the pathological damage in intestine epithelial cell as reports in other references，but also coagulation necrosis under the epicardium，cellular infiltration and granuloma in hepatic cells，inflammatory cells infiltrating in alveolar wall，pancreas epithelial cell swelling and cytoplasm dissolving and karyopyknosis or fragmentation.Immunochemistry staining results showed that positive bacterial antigen signals were found in cytoplasm of cardiac muscle cell，hepatocyte，alveolar wall，renal tubular epithelium cell，islet cell and intestinal epithelial cell.Pathological damages，heart and hepatic necrosis ofShigellaboydiifrom yak experimentally infecting mice was first reported in this study.Eleven kinds of blood biochemical indexes of experimental mice changed apparently in each infected time point except triglyceride.This study verified that the severity of the pathology was positively correlated with theShigellaboydiiantigen distribution.It was concluded that the isolate was the pantropic bacteria injuring most tissues and cells in mouse，and as well as intestinal，heart，liver，lung，pancreas and kidney were the principal target organs.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.021

收稿日期：2015-05-05

基金項目：中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金青年教師基金項目(2015NZYQN55)；牛羊主要疫病綜合防控技術集成、創(chuàng)新與應用(2012BAD13B06-4)

作者簡介：冉丹丹(1988-)，女，土家族，貴州沿河人，助教，碩士，主要從事動物傳染病防治研究，Tel:028-85709991，E-mail:244934359@qq.com *通信作者：湯承，E-mail:tangcheng101@163.com

中圖分類號：S852.61；S852.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0367-07