胡　波，范志宇，王　芳，魏后軍，宋艷華，仇汝龍，徐為中，薛家賓

(江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所·農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室·國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014)

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兔出血癥病毒衣殼蛋白P區(qū)二聚體的表達及其與受體結合能力分析

胡波，范志宇，王芳*，魏后軍，宋艷華，仇汝龍，徐為中，薛家賓

(江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所·農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室·國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014)

摘要：為檢測兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白(VP60)P區(qū)形成二聚體的能力及其與HBGAs受體結合的能力，作者以pMD19T-VP60為模板擴增包含鉸鏈區(qū)H的P區(qū)基因(HP)并克隆至原核表達載體pET28a(+)中，轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經IPTG誘導表達，獲得HP蛋白。經SDS-PAGE和Western blot檢測，結果顯示，HP蛋白主要以包涵體的形式高效表達，經HisTrap親和柱純化后可形成二聚體結構。通過HBGAs受體結合試驗表明，P區(qū)與完整病毒衣殼相似，能與唾液中的HBGAs受體發(fā)生結合。本研究為進一步開展RHDV衣殼蛋白與受體的相互作用研究奠定基礎。

關鍵詞：兔出血癥病毒；衣殼蛋白；P區(qū)；組織血型抗原；受體結合

兔出血癥(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種烈性病毒性傳染病，該病在全世界范圍內廣泛流行。RHDV屬杯狀病毒，無囊膜，為單股正鏈RNA病毒[1-2]。其含有兩個開放閱讀框(ORF)，衣殼蛋白VP60位于ORF1的3′端，基因長度為1 740 bp，編碼579個氨基酸，是病毒衣殼的最基本的單位，與病毒的致病性和免疫原性密切相關[2]。180個VP60單體以二聚體的形式自聚成RHDV病毒樣顆粒(VLPs)[2-3]。據(jù)X射線晶體研究[3]報道，VP60主要分為三個區(qū)域：NTA(N端臂，1—65 aa)、框架區(qū)(S區(qū)，66—229 aa)、突出區(qū)(P區(qū)，238—579 aa)和連接S與P區(qū)的鉸鏈區(qū)(Hinge，230—237 aa)。S區(qū)形成VLPs的內殼，P區(qū)位于VLPs的外表面，形成VLPs的刺突結構[4]。P區(qū)是宿主抗體識別及靶向的主要區(qū)域，影響病毒的抗原性及病毒粒子與細胞受體的吸附作用，該區(qū)域序列具有較高的變異性[5-7]。

目前研究認為，組織血型抗原(HBGAs)是RHDV的結合受體[2]。K.Nystr?m等[8]比較了各基因型RHDV與各型HBGAs結合的關系，認為HBGAs是RHDV的結合因子，并促進病毒的感染。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RHDV結合ABH組織血型抗原(HBGAs)，并能與合成的A型和H2型多糖發(fā)生特異性結合，且RHDV及其VLPs吸附成年兔呼吸道和消化道上皮細胞依賴于HBGAs的存在[8-9]。缺乏正確HBGAs配體的兔能夠抵抗低劑量RHDV的攻擊[8]。同屬于杯狀病毒的諾如病毒(NVs)與RHDV在晶體結構上十分相似，NVs在侵染時也能夠特異性識別并結合HBGAs受體，其結合位點位于外表面的P二聚體或P亞區(qū)[10-13]，并通過唾液HBGAs結合試驗證實不同基因型NVs與不同型HBGAs具有多種結合模式[14]。本研究構建表達含鉸鏈區(qū)H的VP60 P區(qū)域，對其能否形成二聚體結構進行研究，并進一步分析其與受體HBGAs的結合能力，將為RHDV VLPs的結構與功能的進一步研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1質粒和菌株

質粒pMD19-T-VP60由本實驗室構建并保存[15]；表達載體pET-28a(+)由本實驗室保存；E.coliDH5α感受態(tài)、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2主要試劑和工具酶

DNA Marker DL2000及DL15000、pMD19-T載體、限制性內切酶NdeⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶、凝膠回收純化試劑盒等購自TaKaRa公司；Pfx 高保真酶購自Invitrogen公司，酶標山羊抗小鼠IgG(HRP-IgG)購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自Sigma公司；96孔酶標反應板購自南京賽研生物技術有限責任公司；抗VP60 P區(qū)單克隆抗體3D11由本實驗室制備并保存；H型HBGA唾液樣品由本實驗室鑒定并保存；其他試劑均為國產分析純。

1.3兔出血癥病毒HP基因的擴增

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫RHDV中國皖阜株VP60序列(FJ794180，RHDVa型)，利用Primer 5.0軟件設計合成一對擴增HP基因的特異性引物，由Invitrogen公司合成，上游引物HP-F：5′-TCGCATATGTCCAGCAAAACTGTTGACTC-3′；下游引物HP-R：5′-GCCAAGCTTTCAGACAT-AAGAAAAGCC-3′。在上游引物的5′端引入NdeⅠ酶切位點，下游引物的5′端引入HindⅢ 酶切位點。以本實驗室構建保存的質粒pMD19-T-VP60為模板擴增HP基因。反應體系如下：50倍稀釋的模板 1 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，50 mmol·L-1MgSO42 μL，10 mmol·L-1上下游引物各1 μL，10×Pfx Buffer 5 μL，Pfx高保真酶0.4 μL，加ddH2O至總體積50 μL；然后執(zhí)行下列反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸80 s，30個循環(huán)；68 ℃延伸5 min，結束反應。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，膠回收試劑盒純化后備用。

1.4重組表達載體pET-28a-HP的構建

PCR產物與pET-28a質粒同時進行NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，T4DNA連接酶16 ℃連接1 h后，轉化DH5α感受態(tài)細胞，經雙酶切鑒定，獲得重組表達載體pET-28a-HP，并送Invitrogen公司測序。

1.5HP蛋白的誘導表達

將重組質粒pET-28a-HP轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，挑取單菌落接種到含卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，按1∶100體積比將培養(yǎng)物接種于含卡那霉素抗性的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.6時，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，16 ℃誘導表達過夜，12 000 r·min-1離心收集菌體，PBS重懸后冰浴超聲破碎，分別收集上清和沉淀，進行12% SDS-PAGE電泳分析。

1.6HP蛋白的純化及Western blot鑒定

按“1.5”的方法大量誘導表達HP蛋白，經超聲破碎后，以含8 mol·L-1尿素的包涵體溶解液溶解沉淀，并用HisTrap親和柱純化目的蛋白質，具體操作按親和層析柱說明書進行。將純化后的HP蛋白透析去除尿素，所得產物進行還原和非還原SDS-PAGE。采用半干轉印法將蛋白質轉移至NC膜，以針對VP60 P區(qū)的單抗3D11(1∶1 000稀釋)為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗進行反應，ECL顯色觀察結果。

1.7HP蛋白與受體HBGAs結合試驗

利用已建立的HBGAs結合試驗方法(參考諾如病毒與HBGAs結合試驗[16]建立)驗證HP蛋白與受體HBGAs的結合。具體步驟：將含H型HBGA的唾液樣品以PBS(pH7.4)按1∶1 000稀釋，包被96孔酶標板，4 ℃過夜后以5%的脫脂乳封閉2 h，PBST洗滌后加入HP蛋白，37 ℃ 孵育1.5 h，同時設VLPs陽性對照(VP60[15])、陰性對照(pET28a空載體誘導蛋白)和空白對照(PBS)。單抗3D11(1∶2 000稀釋)和HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)反應后以TMBS底物顯色10～15 min，2 mol·L-1H2SO4終止反應，酶標儀上測定OD450 nm值。

2結果

2.1pET-28a-HP重組表達載體的構建及鑒定

通過PCR擴增獲得兔出血癥病毒HP基因。經1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，獲得大小約為1 053 bp的目的片段(圖1)。PCR產物經NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后定向插入經相同酶切的pET-28a(+)載體中，經雙酶切鑒定，獲得重組表達載體pET-28a-HP(圖2)，測序結果表明其為HP基因，與皖阜株序列相似性為100%。

2.2HP蛋白的表達及純化

將重組質粒pET-28a-HP轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經IPTG誘導表達，超聲破碎后，上清和沉淀的SDS-PAGE電泳結果顯示，在約37 ku處有一條明顯的蛋白質條帶，與預期大小一致。表明重組HP蛋白主要以包涵體形式表達，上清中幾乎不表達。經HisTrap親和柱純化包涵體后，獲得較純凈的目的蛋白質(圖3)。

2.3HP蛋白的鑒定

純化的HP蛋白經SDS-PAGE電泳分離后，與還原HP樣品(+β巰基乙醇)相比，非還原HP樣品(-β巰基乙醇)在約74 ku處多出一條蛋白質條帶(圖4的1、2條帶)，經Western blot鑒定，結果顯示，37和74 ku處的蛋白質均為HP蛋白(圖4的3、4條帶)，說明純化后的HP蛋白可形成二聚體結構。2.4HP與HBGAs結合檢測

將HP蛋白做一系列梯度稀釋后進行HBGAs結合試驗。結果顯示，隨著HP蛋白濃度的增加，HP蛋白與H型HBGAs結合反應的OD450 nm值隨之增大，而陰性和空白對照的OD450 nm值均小于0.2，表明HP蛋白能夠與H型HBGAs發(fā)生結合(圖5)。

3討論

RHDV衣殼蛋白VP60可自聚成VLPs并具有受體結合能力[2]。根據(jù)VP60的基因型分析，RHDV可分為RHDV經典型(G1-G5)、RHDVa型(G6)和RHDVb型(RHDV2)，且經典型RHDV與RHDVa的相似性明顯高于RHDVb與前兩者的相似性[17-19]。中國流行株除國內外首次暴發(fā)的毒株WX84外，均為RHDVa型[20]。RHDVa型毒株衣殼蛋白的S區(qū)高度保守，P區(qū)可進一步分為P1亞區(qū)(238—286、450—466、484—579 aa)和P2亞區(qū)(287—449、467—483 aa)。P2亞區(qū)位于病毒衣殼表面，含有病毒株特異性抗原表位和紅細胞結合位點，其變異程度高于P1亞區(qū)[3]。

近年來研究認為HBGAs是RHDV的結合受體，在宿主RHD感染中起重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)從感染兔肝提取物中的天然RHDV和重組病毒衣殼蛋白均發(fā)現(xiàn)能夠特異性地結合HBGAs多糖，并黏附于成年兔的上呼吸道、消化道上皮細胞[8-9]。之后通過核磁共振試驗證實了在RHDV與HBGAs結合中，HBGAs上的L-巖藻糖是RHDV-VLPs最小的識別結構[21]。但RHDVa-VLPs上P區(qū)所形成的刺突結構是否包含了與受體HBGAs結合的所有要素，以及P區(qū)上哪些氨基酸組成了HBGAs的結合域卻并不明確。由于同屬杯狀病毒的諾如病毒(NVs)受體也為HBGAs，因此X.Wang等[3]在通過冷凍電子顯微鏡和晶體學等方法解析了RHDVa型病毒的結構后，將其與NVs晶體結構尤其是受體結合部位的結構進行了比較，發(fā)現(xiàn)RHDVa不具有NVs上與HBGAs相互作用的結合域，兩者與HBGAs的結合方式完全不同，并推測病毒表面的腔洞樣結構可能與受體結合有關。而在NVs受體研究中，不同基因型的NVs就能夠結合不同型的HBGAs受體，該結合與P2亞區(qū)的RGD/NGR樣結合域有關，但不同型的結合位點并不完全相同[14]，同時研究表明形成顆粒結構的P蛋白比P二聚體及單體具有更強的受體結合能力[22]。在RHDVb型病毒的研究中，M.M.Leuthold等[23]通過X射線晶體學方法發(fā)現(xiàn)，HBGAs結合于RHDVb型病毒表面P區(qū)所形成的二聚體的交界面處，且P區(qū)的幾個保守位點與結合密切相關。由于RHDVb所具有的獨特的基因型和抗原性，且RHDVb衣殼蛋白基因與經典型RHDV和RHDVa的相似性甚至低于兔杯狀病毒(RCV)與后兩者之間的相似性，因此也有學者認為RHDVb不屬于RHDV的突變株，而是一種新發(fā)現(xiàn)的兔病毒[19]。由此推測，RHDVa P蛋白有形成多聚體的可能，且RHDVa和RHDVb與受體HBGAs的結合模式可能不同。為研究RHDVa表面氨基酸與受體HBGAs的結合域，RHDVa病毒衣殼蛋白外表面的P區(qū)是最佳對象。

本研究選擇皖阜株RHDV(RHDVa型)作為代表研究RHDVa與HBGAs的結合。采用pET28a(+)表達載體和NdeⅠ、HindⅢ插入位點以保證所表達的HP蛋白上除His標簽和thrombin裂解位點外，無其他外源氨基酸。經Western blot檢測表明，包含鉸鏈區(qū)H的P蛋白可以形成二聚體結構。結合試驗證實，P區(qū)與完整病毒衣殼相似，能與H型HBGA發(fā)生結合。這表明RHDVa衣殼蛋白形成的VLPs結構對于HBGAs受體的結合是非必需的，且P區(qū)中包含受體結合中必不可少的氨基酸組成和結構特征。但P區(qū)二聚體的形成是否增強了P蛋白與受體HBGAs的結合力尚有待進一步研究。以上結果表明所表達的P區(qū)的結構特征對于RHDV衣殼蛋白與HBGAs受體的相互作用的研究具有重要意義，原核表達的P區(qū)可作為病毒與受體相互作用研究的模型。

4結論

成功構建兔出血癥病毒HP基因的表達質粒，并驗證HP蛋白的表達，證實包含鉸鏈區(qū)H的P蛋白能形成二聚體結構。HBGAs受體結合試驗證明HP蛋白與完整VLPs相似，能與唾液中的HBGAs受體發(fā)生結合。這表明HP蛋白可替代VLPs作為研究受體結合的模型。

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(編輯白永平)

Expression of the P Dimer of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Capsid Protein and Analysis of Its Binding Ability to Receptor

HU Bo，F(xiàn)AN Zhi-yu，WANG Fang*，WEI Hou-jun，SONG Yan-hua，QIU Ru-long，XU Wei-zhong，XUE Jia-bin

(InstituteofVeterinaryMedicine，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnologyofMinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products，Nanjing210014，China)

Key words:RHDV；capsid protein；P domain；HBGAs；receptor binding

Abstract:Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) is a member of theCaliciviridaefamily (Lagovirusgenus).Similar to human norovirus (Caliciviridae，Norovirusgenus)，RHDV binds histo-blood group antigens (HBGAs) and this is thought to be important for infection.The aim of this study was to determine whether the P domain of RHDV capsid protein (VP60) could form dimers and to analyze its binding ability to HBGAs receptor.The P domain gene containing hinge (HP) was amplified and cloned into pET-28a (+) expression vector and introduced intoEscherichiacoliBL21 (DE3).The recombinant HP protein，confirmed by SDS-PAGE and Western blot，was effectively expressed in form of inclusion bodies by inducing with IPTG.The recombinant protein was then purified with HisTrap affinity chromatography，which could form dimers after purification.The HBGAs binding assay showed that the P domain bound H type HBGA with the same patterns as those of the intact viral capsids.Further structural studies with P domain are needed in order to better understand the HBGA binding mechanisms and virus-receptor interaction.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.015

收稿日期：2015-06-20

基金項目：現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-44)；江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目[CX (13) 5029]

作者簡介：胡波(1982- )，男，江蘇南京人，助理研究員，碩士，主要從事畜禽疫病防控與獸醫(yī)生物技術研究，Tel：025-84390337，E-mail：hadisi2002@163.com *通信作者：王芳，研究員，E-mail：rwangfang@126.com

中圖分類號：S858.291；S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0325-06