趙妙妙，姜曉龍，陳建偉，黃　洋，姚曉磊，曹　霞，李鵬飛，呂麗華*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

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FSH及Wnt信號(hào)通路對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖及雌激素分泌的影響

趙妙妙1，姜曉龍1，陳建偉1，黃洋1，姚曉磊1，曹霞1，李鵬飛2，呂麗華1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

摘要：旨在研究Wnt信號(hào)通路對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖及雌激素分泌的影響，探究其是否與促卵泡素(Follicular stimulating hormone，F(xiàn)SH)有關(guān)。在添加有FSH以及不同濃度Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞168 h，利用Guava ViaCount?Reagent測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的變化，利用綿羊ELISA試劑盒檢測(cè)雌激素濃度的變化，利用qRT-PCR檢測(cè)FSH靶基因CYP19和CCND2的相對(duì)表達(dá)量差異。結(jié)果表明，無(wú)論有無(wú)FSH，抑制劑IWR-1使顆粒細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)；當(dāng)有FSH時(shí)，抑制劑IWR-1的添加導(dǎo)致雌激素濃度顯著降低(P<0.05)。IWR-1的濃度為1.0 μmol·L-1時(shí)，對(duì)顆粒細(xì)胞的抑制效果最明顯。IWR-1還導(dǎo)致CYP19和CCND2 mRNA的表達(dá)量降低。綜上表明，Wnt信號(hào)通路對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的生物學(xué)功能具有促進(jìn)作用，并且這種促進(jìn)作用可能與FSH有關(guān)。

關(guān)鍵詞：綿羊；卵泡顆粒細(xì)胞；Wnt信號(hào)通路；IWR-1；細(xì)胞培養(yǎng)

1982年R.Nusse等[1]在研究小鼠乳腺癌時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了Wnt基因。Wnt信號(hào)通路可調(diào)控多種發(fā)生過程如細(xì)胞程序性死亡、增殖、分化和凋亡等[2]。Wnt家族的成員主要有3條不同的信號(hào)通路[3-7]：(l)經(jīng)典的Wnt/β-catenin(CTNNB1)信號(hào)通路，可調(diào)節(jié)核內(nèi)目的基因的表達(dá)；(2)平面的細(xì)胞極性通路(Planar cell polarity pathway)，參與組織極性調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞骨架的重排；(3)Wnt/Ca2+通路，能刺激細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放，并且對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路有一定阻礙作用。當(dāng)細(xì)胞未受到刺激時(shí)，軸蛋白(AXIN2)結(jié)合到CTNNB1/糖原合酶激酶(CSK3)/結(jié)腸癌抑制因子(APC)復(fù)合體當(dāng)中，導(dǎo)致CTNNB1迅速降解，信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)閉；而當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt配體與受體卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)ZD)以及LDL受體相關(guān)蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)結(jié)合形成三聚體，從而激活蓬亂蛋白(Dishevelled1，Dsh1/DVL1)，使DVL1與AXIN2相結(jié)合，導(dǎo)致AXIN2/CSK3/APC/CTNNB1的復(fù)合體被破壞，致使CTNNB1無(wú)法被降解，故CTNNB1可進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，并對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控[8]。IWR-1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑[9-10]，通過改變AXIN2對(duì)CTNNB1的結(jié)合力從而改變多蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性，使CTNNB1被降解，最終起到抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用[11]。

哺乳動(dòng)物中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的研究最初局限于人和鼠，S.Vainio等[12]發(fā)現(xiàn)：Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)胚胎期小鼠卵巢發(fā)育上具有重要作用。D.Boerboom等[13]研究表明：Wnt/β-catenin信號(hào)通路的錯(cuò)誤調(diào)控將引發(fā)卵巢顆粒細(xì)胞腫瘤?？梢姡琖nt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)哺乳動(dòng)物卵巢及卵巢顆粒細(xì)胞具有一定的作用。FSH作為一種重要的促性腺激素，與卵巢顆粒細(xì)胞也存在密切聯(lián)系，高慶華等[14]研究表明：FSH能誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞增殖及提高其雌激素合成能力，顆粒細(xì)胞雌激素的合成能力與生理濃度的FSH存在劑量依賴關(guān)系。P.S.Gupta等[11]研究發(fā)現(xiàn)：Wnt信號(hào)通路可增強(qiáng)FSH在牛優(yōu)勢(shì)卵泡選擇中的活動(dòng)。因此，在哺乳動(dòng)物的繁殖調(diào)控過程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與FSH之間可能存在一些影響。

本研究在有或無(wú)最適濃度FSH以及不同濃度Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞，觀察其對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖及雌激素分泌的影響。明確Wnt信號(hào)通路對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步研究Wnt信號(hào)通路的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料及主要試劑

本試驗(yàn)選用山西省晉中市清徐縣綿羊屠宰場(chǎng)性成熟綿羊的健康卵巢。

MEMα基礎(chǔ)培養(yǎng)液、非必需氨基酸(NEAA)、促卵泡素(FSH)、兩性霉素B(Invitrogen，美國(guó))、DMSO、胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清蛋白(BSA)、亞硒酸鈉(Na2SeO3)、雄激素、碳酸氫鈉(NaHCO3)、胰蛋白酶(Sigma，美國(guó))、臺(tái)盼藍(lán)、氨芐青霉素、鏈霉素(上海生物工程公司)、IWR-1(上海藍(lán)木化工有限公司)、Guava ViaCount?Reagent(Millipore，美國(guó))、Sheep Estradiol Elisa(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的收集：將采集的健康卵巢快速帶回實(shí)驗(yàn)室，認(rèn)真分離并選取大小適中(3 mm<卵泡直徑<5 mm)的卵泡，用無(wú)菌的杜氏磷酸緩沖液(DPBS)漂洗兩次。在超凈臺(tái)內(nèi)，剪開卵泡并放入盛有培養(yǎng)液的小表面皿中，用刮刀輕輕刮動(dòng)卵泡內(nèi)壁。收集帶有顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)液，500 r·min-1離心后棄底部雜質(zhì)，然后1 400 r·min-1離心，棄上清，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。

1.2.1.2活細(xì)胞密度檢測(cè)：取少量顆粒細(xì)胞懸液與等體積0.4%的臺(tái)盼藍(lán)混合，染色1 min，利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察并計(jì)算活細(xì)胞濃度，算出每個(gè)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.1.3顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)：根據(jù)上述計(jì)算結(jié)果稀釋細(xì)胞懸液，并將其接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔的活細(xì)胞數(shù)約為2萬(wàn)個(gè)。細(xì)胞被分為A、B兩大組進(jìn)行培養(yǎng)，1組未添加FSH(添加與FSH等量的培養(yǎng)液)，第2組添加最適濃度(5 ng·mL-1)的FSH[24]。每組內(nèi)再繼續(xù)分為對(duì)照組(A1/B1)以及添加不同濃度(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)的Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1的試驗(yàn)組(A2、A3、A4/B2、B3、B4)。每個(gè)濃度的培養(yǎng)孔做3個(gè)重復(fù)。

1.2.1.4細(xì)胞液的收集：細(xì)胞培養(yǎng)168 h后，將細(xì)胞上清液移入無(wú)菌EP管內(nèi)，-20 ℃儲(chǔ)存，測(cè)雌激素濃度備用。

1.2.1.5細(xì)胞活率檢測(cè)：向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入37 ℃的胰酶100 μL消化處理5～10 min，然后加入100 μL 10% FBS終止消化。移出細(xì)胞懸液50 μL，并加入Guava ViaCount· Reagent工作液450 μL，靜置10 min(避光)，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行活率檢測(cè)。收集其余細(xì)胞懸液，-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.1.6雌激素測(cè)定[15]：雌激素的測(cè)定是利用綿羊ELISA試劑盒，按照說明書進(jìn)行正規(guī)操作，最后利用酶標(biāo)儀讀取OD值，并計(jì)算雌激素濃度。

1.2.2FSH靶基因表達(dá)量檢測(cè)

1.2.2.1總RNA的提取：將1.2.1.5 -80 ℃儲(chǔ)存的懸液從冰箱取出，用Trizol法提取總RNA[16]。

1.2.2.2cDNA合成：按照PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明，加入1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，2 μL RNA，RNase Free定容到10 μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min，4 ℃ 5 min。加入1 μL RT Primer Mix，4 μL 5×PrimeScript?Buffer 2，1 μL PrimeScript?RT Enzyme Mix I，RNase Free定容到20 μL。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)產(chǎn)物純度及濃度，于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2.3引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)NCBI上綿羊的預(yù)測(cè)序列，利用Primer 3和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)目的基因的引物；以綿羊β-Actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1熒光定量PCR引物序列

Table 1Primers sequence of quantitative PCR

1.2.2.4qRT-PCR反應(yīng)：以之前細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中的A1、A3、B1、B3的cDNA為模板，構(gòu)建20 μL qRT-PCR 反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)10 μL， Rox Reference Dye(50×)0.4 μL，PCR 上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后軟件自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線、熔解曲線，利用其CT值分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS(Statistic Package for Social Science 18.0)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)的方法。qRT-PCR 相對(duì)表達(dá)量結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)”表示，采用△△CT的計(jì)算方法，相對(duì)表達(dá)量= 2-△△CT。各基因表達(dá)量均經(jīng)內(nèi)參β-Actin校正。

2結(jié)果

2.1FSH和IWR-1處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞168 h后生長(zhǎng)狀況

由圖1可見，在A、B組中，對(duì)照組(A1/B1)與試驗(yàn)組(A2、A3、A4/B2、B3、B4)相比，生長(zhǎng)狀況相對(duì)較好，細(xì)胞數(shù)目較多，聚團(tuán)現(xiàn)象明顯；長(zhǎng)勢(shì)最佳的是添加有FSH但無(wú)IWR-1的(B1)組，細(xì)胞數(shù)目最多，聚團(tuán)最明顯。可見，在體外培養(yǎng)的條件下，F(xiàn)SH可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)，而Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1可抑制顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.2FSH和IWR-1處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞168 h后細(xì)胞數(shù)目的變化

由圖2可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中無(wú)IWR-1但添加有最適濃度5 ng·mL-1的FSH時(shí)，顆粒細(xì)胞數(shù)目最多，顯著高于其他組別(P<0.05)；無(wú)論是否有外源FSH存在，IWR-1的添加使顆粒細(xì)胞數(shù)目下降，但是當(dāng)IWR-1濃度到達(dá)一定濃度后，細(xì)胞數(shù)目反而有所上升。未添加FSH的試驗(yàn)組中，IWR-1濃度為0.1和1.0 μmol·L-1時(shí)細(xì)胞數(shù)目最少；添加有FSH的試驗(yàn)組中，IWR-1濃度為1.0 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞數(shù)目顯著少于其他組(P<0.05)。FSH可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，而IWR-1可以抑制顆粒細(xì)胞的增殖。

2.3FSH和IWR-1處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞168 h后雌二醇濃度變化

由圖3可看出，當(dāng)培養(yǎng)基中只添加有5 ng·mL-1的FSH時(shí)，雌激素濃度最大，顯著高于其他組(P<0.05)；無(wú)FSH的試驗(yàn)組中，IWR-1的添加對(duì)雌激素的分泌無(wú)顯著影響，有FSH的試驗(yàn)組中，IWR-1的添加使雌激素濃度降低，當(dāng)IWR-1濃度為0.1和1.0 μmol·L-1時(shí)，雌激素濃度顯著小于其他組(P<0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)SH可促進(jìn)顆粒細(xì)胞雌激素的分泌，IWR-1可以抑制顆粒細(xì)胞雌激素的分泌，且IWR-1的抑制作用可能與FSH 有關(guān)。

2.4FSH和IWR-1處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞168 h后FSH靶基因的表達(dá)差異

由圖4可看出，在培養(yǎng)基中添加最適濃度的FSH，促使基因CYP19和CCND2表達(dá)量升高，而IWR-1的作用又會(huì)降低CYP19 mRNA和CCND2 mRNA的表達(dá)量。表明，IWR-1可降低FSH對(duì)顆粒細(xì)胞的促進(jìn)作用。

3討論

FSH是一種重要的促性腺激素，可調(diào)控哺乳動(dòng)物卵泡的發(fā)生；能夠結(jié)合顆粒細(xì)胞中的FSH受體，激活cAMP通路，從而調(diào)節(jié)芳香化酶的活性[17]，進(jìn)而促使哺乳動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞的數(shù)目增多，顆粒細(xì)胞的雌激素濃度增大[18-22]。顆粒細(xì)胞的增殖以及雌激素的合成都與體外添加的FSH濃度有關(guān)[23]。李鵬飛等[24]研究綿羊卵泡顆粒細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FSH濃度為5 ng·mL-1時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。

有研究證實(shí)，Wnt信號(hào)通路對(duì)卵巢中類固醇生成有重要的調(diào)控作用[25]。本試驗(yàn)探究Wnt信號(hào)通路對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的調(diào)控是通過使用通路抑制劑IWR-1來(lái)研究的。抑制劑IWR-1可破壞細(xì)胞質(zhì)AXIN2依賴的復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而阻礙對(duì)CTNNB1的降解作用，最終阻礙Wnt/β-catenin信號(hào)通路[9-11]。

本研究表明，F(xiàn)SH促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液中添加最適濃度(5 ng·mL-1)的FSH時(shí)，顆粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象明顯，雌激素濃度增大。Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1的作用可抑制顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)IWR-1濃度為0.1、1.0 和10.0 μmol·L-1時(shí)，對(duì)顆粒細(xì)胞均有抑制效果，但1.0 μmol·L-1的IWR-1抑制效果最明顯，顆粒細(xì)胞數(shù)目最少，聚集生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)最少，雌激素分泌量最少，因此1.0 μmol·L-1為抑制效果最強(qiáng)的抑制劑IWR-1濃度。此外，當(dāng)培養(yǎng)基中未添加FSH時(shí)，抑制劑濃度為0.1與1.0 μmol·L-1的試驗(yàn)組之間以及對(duì)照組與10.0 μmol·L-1的試驗(yàn)組之間，顆粒細(xì)胞的增殖數(shù)目無(wú)顯著差異，同樣，在無(wú)FSH時(shí)，雌激素的濃度在對(duì)照組與0.1、1.0 μmol·L-1的抑制劑組之間均無(wú)顯著差異。然而當(dāng)培養(yǎng)基中添加最適濃度的FSH時(shí)，無(wú)論是顆粒細(xì)胞的增值數(shù)目還是雌激素濃度，在各試驗(yàn)組之間均出現(xiàn)顯著差異。表明，F(xiàn)SH增強(qiáng)了IWR-1對(duì)顆粒細(xì)胞的抑制效果。

CYP19基因可以編碼芳香化酶，當(dāng)雌激素合成時(shí)能夠催化雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，在雌激素的合成過程中起重要的調(diào)控作用[26-27]。CCND2基因可以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖[28]。有研究表明，CYP19和CCND2都是FSH的靶基因，F(xiàn)SH的作用會(huì)使細(xì)胞內(nèi)CYP19和CCND2 mRNA的表達(dá)量增加[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1降低了細(xì)胞內(nèi)由于FSH誘導(dǎo)的CYP19 mRNA的增加量，而對(duì)于CCND2 mRNA也同樣表現(xiàn)出相似的結(jié)果。這與P.S.Gupta等[11]的研究結(jié)果：Wnt信號(hào)通路可以增強(qiáng)FSH在牛優(yōu)勢(shì)卵泡選擇中的活動(dòng)，具有一定程度上的一致性。

4結(jié)論

Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和雌激素的分泌。不同濃度的Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖和雌激素分泌存在不同的抑制效果，當(dāng)IWR-1的濃度為1.0 μmol·L-1時(shí)，抑制效果最明顯。此外，Wnt信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)FSH在顆粒細(xì)胞中的作用，綜上表明，Wnt信號(hào)通路對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的影響，可能是通過調(diào)節(jié)FSH的作用來(lái)發(fā)揮的。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]NUSSE R，VARMUS H E.Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirns integrated in the same region of the host genome[J].Cell，1982，31(1)：99-109.

[2]SEGDITSAS S，TOMLINSON I.Colorectal cancer and genetic alterations in the Wnt pathway[J].Oncogene，2006，25(57)：7531-7537.

[3]WODARZ A，NUSSE R.Mechanisms of Wnt signaling in development[J].AnnuRevCellDevBiol，1998,14：59-88.

[4]KIKUCHI A，YAMAMOTO H，KISHIDA S.Multiplicity of the interactions of Wnt proteins and their receptors[J].CellSignal，2007,19(4)：659-671.

[5]尹定子，宋海云.Wnt信號(hào)通路:調(diào)控機(jī)理和生物學(xué)意義[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(2)：103-111.

YIN D Z，SONG H Y.Regulation of Wnt signaling:Mechanism and Biological significance[J].ChineseJournalofCellBiology，2011，33(2)：103-111.(in Chinese)

[6]劉烜，王海生，劉淑萍.Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞凋亡[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2011，43(1)：50-53.

LIU X，WANG H S，LIU S P.Wnt signal transduction pathway and apoptosis[J].InnerMongoliaMedicalJournal，2011，43(1)：50-53.(in Chinese)

[7]WILLERT K，BROWN J D，DANENBERG E，et al.Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors[J].Nature，2003，423(6938)：448-452.

[8]BOYER A，GOFF A K，BOERBOOM D.WNT signaling in ovarian follicle biology and tumorigenesis[J].TrendsEndocrinolMetab，2010，21(1)：25-32.

[9]CHEN B，DODGE M E，TANG W，et al.Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer[J].NatChemBiol， 2009，5(2)：100-107.

[10]LU J，MA Z，HSIEH J C，et al.Structure-activity relationship studies of small-molecule inhibitors of Wnt response[J].BioorgMedChemLett，2009，19(14)：3825-3827.

[11]GUPTA P S，F(xiàn)OLGER J K,RAJPUT S K，et al.Regulation and regulatory role of WNT signaling in potentiating FSH action during bovine dominant follicle selection[J].PLoSOne，9(6)：e100201.

[12]VAINIO S，HEIKKILM，KISPERT A，et al.Female development in mammals is regulated by Wnt-4 signalling[J].Nature，1999，397(6718)：405-409.

[13]BOERBOOM D，PAQUET M，HSIEH M，et al.Misregulated Wnt/beta-catenin signaling leads to ovarian granulosa cell tumor development[J].CancerRes，2005，65(20)：9206-9215.

[14]高慶華，周虛，王春清，等.促卵泡激素和胰島素對(duì)牛卵泡顆粒細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26(4)：442-443，447.

GAO Q H，ZHOU X，WANG C Q，et al.Effect of FSH and insulin on bovine granulosa cells in long term serum-cultrue[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2006，26(4)：442-443，447.(in Chinese)

[15]李鵬飛，岳文斌，李富祿，等.可卡因-苯丙胺調(diào)控轉(zhuǎn)錄肽(CART)對(duì)豬卵巢卵泡顆粒細(xì)胞雌激素產(chǎn)生的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43(12)：1879-1886.

LI P F，YUE W B，LI F L，et al.Effects of CART on estradiol production of pig ovarian follicular granulosa cellsinvitroculture[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2012，43(12)：1879-1886.(in Chinese)

[16]姜曉龍.DAPT 阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞功能的影響[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

JIANG X L.Effect of Notch signaling pathway blocked with DAPT on function of sheep granulosa cellsinvitro[D].Taigu：Shanxi Agricultural University,2013.(in Chinese)

[17]王鋒.卵泡生長(zhǎng)發(fā)育成熟及其內(nèi)分泌調(diào)控[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1994，19(1)：1-8.

WANG F.Mature follicle growth and endocrine regulation[J].ProgressinVeterinaryMedicine，1994，19(1)：1-8.(in Chinese)

[18]SEN A，Lü L，BELLO N，et al.Cocaine- and amphetamine-regulated transcript accelerates termination of follicle-stimulating hormone-induced extracellulary regulated kinase 1/2 and Akt activation by regulating the expression and degradation of specific mitogen-activated protein kinase phosphatases in bovine granulosa cells[J].MolEndocrinol，2008，22(12)：2655-2676.

[19]Lü L H，JIMENEZ-KRASSEL F，SEN A，et al.Evidence supporting a role for cocaine- and amphetamineregulated transcript(CARTPT) in control of granulosa cell estradiol production associated with dominant follicle selection in cattle[J].BiolReprod，2009，81(3)：580-586.

[20]HUGHES F M J R，GOROSPE W C.Biochemical identification of apoptosis(programmed cell death) in granulosa cells：evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia[J].Endocrinology，1991，129(5)：2415-2422.

[21]Lü L H，JIMENEZ-KRASSEL F，SEN A，et al.Evidence for a local inhibitory effect of the CART peptide on LH-induced thecal and rostenedione production[J].BiolReprod，2007，77(Suppl 1)：179.

[22]HUNZICKER-DUNN M，MAIZELS E T.FSH signaling pathways in immature granulosa cells that regulate target gene expression：branching out from protein kinase A[J].CellSignal，2006，18(9)：1351-1359.

[23]CAMPBELL B K,SCARAMUZZI R J,WEBB R.Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media[J].JReprodFertil，1996，106(1)：7-16.

[24]李鵬飛，岳文斌，龐鈺瑩，等.FSH和胰島素對(duì)綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44(9)：1386-1391.

LI P F，YUE W B，PANG Y Y，et al.Effects of FSH and insulin on sheep ovarian follicular granulosa cellsinvitroculture[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(9)：1386-1391.(in Chinese)

[25]LAPOINTE E，BOERBOOM D.WNT signaling and the regulation of ovarian steroidogenesis[J].FrontBiosci(ScholEd)，2011，3：276-285.

[26]ZHAO Y，MENDELSON C R，SIMPSON E R.Characterization of the sequences of the humanCYP19(aromatase) gene that mediate regulation by glucocorticoids in adipose stromal cells and fetal hepatocytes[J].MolEndocrinol，1995，9(3)：340-349.

[27]LUO W，WILTBANK M C.Distinct regulation by steroids of messenger RNAs for FSHR and CYP19A1 in bovine granulosa cells[J].BiolReprod，2006，75(2)：217-225.

[28]HAN Y，XIA G，TSANG B K.Regulation of cyclin D2 expression and degradation by follicle-stimulating hormone during rat granulosa cell proliferationinvitro[J].BiolReprod，2013，88(3)：57.

[29]SEN A，BETTEGOWDA A，JIMENEZ-KRASSEL F，et al.Cocaine-and amphetamine regulated transcript regulation of follicle-stimulating hormone signal transduction in bovine granulosa cells[J].Endocrinology，2007，148(9)：4400-4410.

(編輯程金華)

Effects of FSH and Wnt Signaling Pathway on Proliferation and Estrogen Secretion of Sheep Granulosa Cells

ZHAO Miao-miao1，JIANG Xiao-long1，CHEN Jian-wei1，HUANG Yang1，YAO Xiao-lei1，CAO Xia1，LI Peng-fei2，Lü Li-hua1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.CollegeofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

Key words:sheep；granulosa cells；Wnt signaling pathway；IWR-1；cell culture

Abstract:This study aims to investigate the effect of Wnt signaling pathway on proliferation and estrogen secretion of sheep granulosa cells and to explore whether the effect was related to FSH(Follicular stimulating hormone，F(xiàn)SH).With or without FSH，sheep granulosa cells were cultured in medium with different concentrations of Wnt signaling pathway inhibitor IWR-1 for 168 h.Then，Guava ViaCount?Reagent was used to detect the changes of cell number and sheep ELISA kit was used to detect the changes of estrogen concentrations.The relative expression ofCYP19 andCCND2，which are the target genes of FSH，was analyzed by qRT-PCR.The results showed that IWR-1 could cause a significant(P<0.05) reduction in the number of granule cells whether FSH existed or not.With the presence of FSH，the addition of IWR-1 could significantly(P<0.05) decrease estrogen concentration.When the concentration of IWR-1 was 1.0 μmol·L-1，its inhibitory effect on granulosa cells was of most obvious.Besides，IWR-1 decreased the abundance ofCYP19 mRNA andCCND2 mRNA.In conclusion，Wnt signaling pathway can improve the biological function of sheep granulosa cells，and this function may be related to FSH.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.009

收稿日期：2015-05-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31172211)；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2014-重點(diǎn)5)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科研管理費(fèi)資助重大項(xiàng)目和標(biāo)志性成果培育項(xiàng)目(71060003)

作者簡(jiǎn)介：趙妙妙(1989-)，女，山西大同人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：1203418618@qq.com *通信作者：呂麗華，E-mail：sxaullh@yahoo.com.cn

中圖分類號(hào)：S826.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0064-07