鄧廷賢，龐春英，朱　鵬，段安琴，陸杏蓉，楊炳壯，梁賢威

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001)

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水牛STAT1基因多態(tài)與產(chǎn)奶性狀關(guān)聯(lián)分析

鄧廷賢，龐春英*，朱鵬，段安琴，陸杏蓉，楊炳壯，梁賢威*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001)

摘要：本研究旨在檢測(cè)水牛STAT1基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，探究中國(guó)水牛多態(tài)性位點(diǎn)的群體遺傳特征，尋找與產(chǎn)奶性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。采用PCR和測(cè)序法篩選水牛STAT1基因序列的SNPs，以357頭水牛為研究對(duì)象，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)對(duì)群體進(jìn)行了基因型檢測(cè)，運(yùn)用SAS(9.3)軟件一般線性模型(GLM)對(duì)STAT1基因型與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，在水牛STAT1基因中檢測(cè)出3個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于5′UTR(g.68G>A)、外顯子10(g.986 G>T)和3′UTR(g.2881 C>A)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，水牛STAT1基因g.986G>T位點(diǎn)與305天產(chǎn)奶量和乳脂率顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)。Bonferronit檢驗(yàn)多重比較結(jié)果顯示，基因型TT和GG個(gè)體的305天產(chǎn)奶量顯著高于GT基因型(P<0.05)，基因型TT個(gè)體的乳脂率顯著高于GG和GT基因型(P<0.05)，且305天的產(chǎn)奶量隨著胎次的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，直到第3或4胎次時(shí)達(dá)到最大值，表明胎次是影響水牛產(chǎn)奶量的重要環(huán)境因素之一。本研究表明，水牛STAT1基因的g.986G>T位點(diǎn)可能是影響其產(chǎn)奶性狀的候選分子遺傳標(biāo)記，為今后建立中國(guó)水牛標(biāo)記輔助選擇育種研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水牛；STAT1基因；產(chǎn)奶性狀；飛行時(shí)間質(zhì)譜；關(guān)聯(lián)分析

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(Signal transduction and activators of transcription，STATs) 蛋白家族由7個(gè)家族成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和STAT6 組成，是由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等多肽類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，活化的STAT二聚體化后移位于細(xì)胞核，與特異性DNA 啟動(dòng)子結(jié)合直接參與調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在免疫調(diào)控、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期方面發(fā)揮重要作用[1-3]。其中，STAT1基因主要是通過(guò)參與生長(zhǎng)激素[4]與催乳素[5]的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響哺乳動(dòng)物的泌乳性能。水牛STAT1基因cDNA序列長(zhǎng)3 437 bp，包含1個(gè)2 244 bp的開(kāi)放閱讀框，由25個(gè)外顯子組成，共編碼747個(gè)氨基酸[6]，與奶牛的STAT1基因結(jié)構(gòu)類似[7]?；赟TAT1基因的功能，眾多研究已發(fā)現(xiàn)，STAT1基因在不同組織、不同生理階段均表現(xiàn)出特性的表達(dá)[8]以及存在著大量的與產(chǎn)奶性狀顯著相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait locus，QTL)[9-10]。顯然，STAT1基因可作為哺乳動(dòng)物產(chǎn)奶性狀研究的候選基因。O.Cobanoglu等[11]報(bào)道了荷斯坦奶牛STATl基因3′-UTR的1個(gè)SNP，其中CC和CT基因型與高產(chǎn)奶量、高乳脂率、高乳蛋白率呈正相關(guān)。褚敏等[12]檢測(cè)了STAT1基因的多態(tài)性與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在內(nèi)含子11有2處突變，且為連鎖突變；在 3′-UTR 發(fā)現(xiàn)1處突變；這些突變均影響奶牛的產(chǎn)奶性能。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)，簡(jiǎn)稱飛行時(shí)間質(zhì)譜，是近年來(lái)應(yīng)用在生物大分子檢測(cè)領(lǐng)域的一種新技術(shù)。飛行時(shí)間質(zhì)譜的工作原理是通過(guò)調(diào)整不同SNP位點(diǎn)的引物，設(shè)計(jì)出一組分子質(zhì)量不同的延伸產(chǎn)物，通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定確認(rèn)每個(gè)位點(diǎn)的基因型，具有分型準(zhǔn)確、靈敏高和高通量等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)在家畜育種應(yīng)用中展示出巨大的SNP分型潛力。初芹等[13]利用飛行時(shí)間質(zhì)譜法針對(duì)122頭奶牛59個(gè)SNPs標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行了高信息量SNP篩選，證實(shí)了該技術(shù)選出的高信息量SNP標(biāo)記是可行和可信的。

本研究以水牛為研究對(duì)象，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)STAT1基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并與其產(chǎn)奶性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在從分子水平挖掘與水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的標(biāo)記，為今后開(kāi)展水牛標(biāo)記輔助選擇研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

357頭水牛由廣西水牛研究所種畜場(chǎng)統(tǒng)一飼養(yǎng)管理，營(yíng)養(yǎng)以及管理水平保持一致，該群體包含2個(gè)純種品種(摩拉水牛和尼里-拉菲水牛)以及4個(gè)雜交品種(摩拉×本地，尼里×本地，摩拉×尼里和摩拉×尼里×本地三品雜)。其中從廣西水牛研究所種畜場(chǎng)收集了336頭水牛表型數(shù)據(jù)均用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)個(gè)體采取耳靜脈取血，每2 mL保存于真空采血管中(含肝素鈉抗凝劑)，4 ℃保存。

1.2主要試劑

血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)置于北京天根生物科技有限公司；PCR所用試劑的采購(gòu)來(lái)自寶生物(大連)科技有限公司；PCR引物由寶生物(大連)科技有限公司合成。

1.3PCR擴(kuò)增

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中水牛STAT1基因序列(登錄號(hào)：KJ139981.1)，采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于水牛STAT1基因的PCR擴(kuò)增。以18頭水牛DNA樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物退火溫度和片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系50 μL：含PremixTaq25 μL，基因組總DNA 1 μL，上下游引物混合物 2 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1～1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1STAT1基因SNP篩選引物序列

Table 1Primers sequence used to screen SNPs inSTAT1 gene

1.4SNP篩選

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托深圳華大基因生物科技公司測(cè)序。根據(jù)序列峰圖和DNAStar軟件比對(duì)分析，篩選SNPs位點(diǎn)。

1.5基因分型

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，選擇水牛STAT1基因初步篩選的3個(gè)突變位點(diǎn)(表2)，參照文獻(xiàn)[14]的方法檢測(cè)357頭水牛個(gè)體中各突變位點(diǎn)的SNP分型。

表2水牛STAT1基因SNP位點(diǎn)篩選

Table 2SNP screening ofSTAT1 genes in buffalo

1.6統(tǒng)計(jì)分析

采用PowerMarkerV3.25軟件[15]計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量、群體雜合度，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用SAS(9.3)軟件的GLM過(guò)程對(duì)產(chǎn)奶性狀和STAT1基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。關(guān)聯(lián)分析模型為：Yijk=μ+Gi+Pj+Sk+eijk，其中，Yijk為產(chǎn)奶性狀表型記錄；μ為群體平均值；Gi為基因效應(yīng)；Pj為胎次效應(yīng)；Sk為季節(jié)效應(yīng)；eijk為隨機(jī)殘差。

2結(jié)果

2.1水牛STAT1基因多態(tài)位點(diǎn)的篩選

以18頭水?；蚪M總DNA為模板對(duì)水牛STAT1基因部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和測(cè)序，結(jié)合DNAstar SeqMan軟件比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)水牛STAT1基因有3個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于5′UTR(g.68G>A)、外顯子10(g.986 G>T)和3′UTR(g.2881 C>A)區(qū)域。其中，g.986G>T為錯(cuò)義突變，可造成L280R氨基酸殘基替換。

2.2基因分型

針對(duì)上述篩選的3個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行了水牛群體的SNP基因分型。由圖1可以看出，所有的SNPs位點(diǎn)中均檢測(cè)出有3種常見(jiàn)基因型，平均檢測(cè)率達(dá)98.0%。 以圖1 A為例，g.68G>A位點(diǎn)中野生型GG個(gè)體有180個(gè)，突變雜合子GA個(gè)體有142個(gè)，突變純合子AA個(gè)體有28個(gè)，未檢測(cè)出基因型的只有7個(gè)，表明MALDI-TOF-MS技術(shù)可以精確的檢測(cè)出野生純合子、突變純合子以及突變雜合子等3種常見(jiàn)的基因型，且準(zhǔn)確率很高，可用于后續(xù)分析。

2.3群體遺傳分析

3個(gè)突變位點(diǎn)在357頭測(cè)試群體的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度和多態(tài)信息含量(PIC)等統(tǒng)計(jì)參數(shù)值見(jiàn)表3。由表3可知，g.68G>A位點(diǎn)的GG是優(yōu)勢(shì)基因型，G為優(yōu)勢(shì)等位基因，處于中度多態(tài)狀態(tài)。而g.2881 C>A位點(diǎn)的CC是優(yōu)勢(shì)基因型，C為優(yōu)勢(shì)等位基因，處于低度多態(tài)狀態(tài)。同時(shí)χ2檢驗(yàn)表明，上述3個(gè)SNPs突變位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

2.4STAT1基因突變位點(diǎn)不同基因型對(duì)水牛產(chǎn)奶性狀的影響

305天產(chǎn)奶量、乳蛋白率和乳脂率3個(gè)產(chǎn)奶性狀的最小二乘均值及其與水牛STAT1基因突變位點(diǎn)不同基因型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，水牛STAT1基因g.986G>T位點(diǎn)與305天產(chǎn)奶量和乳脂率的關(guān)聯(lián)程度達(dá)到顯著水平(P<0.05)，但與乳蛋白率差異不顯著；Bonferronit檢驗(yàn)多重比較分析結(jié)果顯示，TT和GG基因型個(gè)體的305天產(chǎn)奶量顯著高于GT型(P<0.05)，基因型TT個(gè)體的乳脂率則均高于GG和GT基因型個(gè)體，其差異顯著(P<0.05)。對(duì)于g.986G>T位點(diǎn)而言，不同的胎次和水牛的305天產(chǎn)奶量關(guān)聯(lián)程度在P<0.05水平上達(dá)到顯著、與乳蛋白率及乳脂率關(guān)聯(lián)不顯著(P>0.05)。由表5可知，水牛305天的產(chǎn)奶量隨著胎次增加呈現(xiàn)逐漸提高的趨勢(shì)，直到第3和4胎次時(shí)達(dá)到最大值，表明胎次是影響水牛產(chǎn)奶量的重要因素之一。

表3水牛STAT1基因突變位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率及遺傳多樣性

Table 3Allele frequency，genotype frequency of SNPs in buffaloSTAT1 gene

表4STAT1突變位點(diǎn)不同基因型與水牛產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析

Table 4Association analysis between SNPs ofSTAT1 gene and milk performance traits in buffalo

相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同The same letter indicated no significant difference，different letters indicated significant difference at the 0.05 level.The same as below

表5g.986G>T位點(diǎn)不同胎次與水牛產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性分析

Table 5Association of parities of g.986G>T with milk production traits in buffalo

3討論

STAT家族蛋白是各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)激素等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)解因子，它們通過(guò)調(diào)解這些因子啟動(dòng)胞內(nèi)JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)胚胎的發(fā)育、器官發(fā)生和功能、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和凋亡的調(diào)控等起著重要作用[9，16]。其中，STAT1、STAT3和STAT5等STAT家族基因可通過(guò)JAK/STAT信號(hào)途徑影響哺乳動(dòng)物的泌乳性能[17-18]，從而引起眾多育種學(xué)家的關(guān)注。已有研究證實(shí)，STAT1[11-12]和STAT5a[19]基因?qū)δ膛５漠a(chǎn)奶性能有顯著影響，但有關(guān)水牛STAT1和STAT5a基因多態(tài)性與其產(chǎn)奶性能之間關(guān)系的研究報(bào)道甚少，僅T.Deng等[6]報(bào)道了STAT1基因的克隆與組織表達(dá)分析以及季敏等[20]報(bào)道了檳榔江水牛STAT5a基因遺傳多態(tài)性分析，共發(fā)現(xiàn)了38個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中4個(gè)SNPs位于外顯子，34個(gè)SNPs位于內(nèi)含子，4個(gè)外顯子SNPs沒(méi)有導(dǎo)致氨基酸的變化，屬于同義突變。

本研究利用PCR測(cè)序法在水牛STAT1基因序列中篩查出3個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于5′UTR(g.68G>A)、exon10(g.986 G>T)和3′UTR(g.2881 C>A)。其中g(shù).68G>A和g.986 G>T位點(diǎn)的PIC含量分別為0.353 0和0.400 3，根據(jù)PIC大小與遺傳多樣性等級(jí)表明這2個(gè)位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)[21]。g.2881 C>A位點(diǎn)的PIC含量為0.220 4，屬于低度多態(tài)。同時(shí)χ2檢驗(yàn)表明，上述3個(gè)SNPs突變位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，表明這些位點(diǎn)在水牛培育過(guò)程中還未受到人工選擇和選育影響。

本研究中，水牛STAT1基因g.986 G>T位點(diǎn)對(duì)其產(chǎn)奶量和乳脂率具有顯著的影響作用(P<0.05)，且TT和GG基因型個(gè)體的305天產(chǎn)奶量顯著高于GT型(P<0.05)，基因型TT個(gè)體的乳脂率則均高于GG和GT基因型個(gè)體，其差異顯著(P<0.05)；TT基因型個(gè)體的乳蛋白率也高于GG和GT基因型，但差異不顯著(P>0.05)。由表4可看出，水牛305天的產(chǎn)奶量與乳脂率呈正相關(guān)，F(xiàn).M.Gil等[22]的研究結(jié)果類似，卻與奶?！爱a(chǎn)奶量與乳脂率為負(fù)相關(guān)”的觀點(diǎn)相反[19，23]。在g.986 G>T位點(diǎn)，305天的產(chǎn)奶量隨著胎次的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，直到第3或4胎次時(shí)達(dá)到頂峰，推測(cè)胎次是影響水牛群體產(chǎn)奶量的重要環(huán)境因素。顯然，對(duì)g.986 G>T位點(diǎn)而言，T等位基因?qū)τ谔岣咚．a(chǎn)奶性能具有一定的優(yōu)勢(shì)，且χ2檢驗(yàn)表明該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，推測(cè)所研究的水牛群體受人工選擇或選育影響較小，在以后的選擇過(guò)程中，應(yīng)逐步考慮優(yōu)勢(shì)等位基因的固定，同時(shí)注意胎次的影響，以提高水牛產(chǎn)奶性能。但是由于本研究中的試驗(yàn)樣本量較小，需要進(jìn)一步在大群體中去驗(yàn)證，以鑒定該位點(diǎn)是否可以作為影響水牛產(chǎn)奶性能的有效分子標(biāo)記，為今后開(kāi)展水牛標(biāo)記輔助選擇育種研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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(編輯郭云雁)

Association between Polymorphism ofSTAT1 Gene and Milk Production Traits in Buffalo (Bubalusbubalis)

DENG Ting-xian，PANG Chun-ying*，ZHU Peng，DUAN An-qin，LU Xing-rong，YANG Bing-zhuang，LIANG Xian-wei*

(KeyLaboratoryofBuffaloGenetics，BreedingandReproductionTechnology，MinistryofAgricultureandGuangxi，BuffaloResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Nanning530001，China)

Key words:buffalo；STAT1 gene；milk production traits；matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry；association analysis

Abstract:This study aimed to identify single nucleotide polymorphism (SNP) of the buffaloSTAT1 gene，investigate population genetics characters of SNPs and find molecular markers for milk production traits in Chinese buffaloes.The polymorphisms ofSTAT1 gene were detected by PCR and sequencing methods.Population genetic polymorphisms for 357 buffaloes were genotyped by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technology，and the associations analysis between genotypes and milk production traits was performed by the SAS (9.3) software with generalized linear model.The results showed that the total of 3 SNPs were detected on the 5′UTR，exon10 and 3′UTR inSTAT1 gene，namely g.68G>A，g.986 G>T and g.2881 C>A，respectively.Association analysis indicated that 305-day milk yield and fat percentage were significantly associated with the g.986 G>T ofSTAT1 gene (P<0.05).The results of Bonferronit-test revealed that 305-day milk yield of individuals with TT and GG genotypes were significantly higher than those with GT genotypes (P<0.05)，and fat percentage of individuals with TT genotype were significantly higher than those with GG and GT genotypes (P<0.05).And the 305-day milk yield tended to increase from first to later parities，reaching the maximum at the 3rd or 4th calving，indicating that parity was one of factors affecting the milk production of buffalo.Our findings in this study implied that the g.986 G>T ofSTAT1 gene might be a candidate molecular marker for milk production traits in buffalo，which provide a foundation for studying the marker-assisted selection programs in Chinese buffaloes.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.007

收稿日期：2015-01-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)(2014DFA31970)；桂漁牧科(1304512)

作者簡(jiǎn)介：鄧廷賢(1983-)，男，湖南郴州人，碩士，助理研究員，主要從事水牛分子遺傳學(xué)研究，E-mail：dtx282000@163.com *通信作者：梁賢威，研究員，主要從事水牛繁殖與營(yíng)養(yǎng)研究，E-mail：liangbri@126.com；龐春英，副研究員，主要從事水牛遺傳育種研究，E-mail：pangcy800@163.com

中圖分類號(hào)：S823.83;S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0048-07