毛俊麗綜述，王　拓，孫勇審校，陳紅亮，趙　峰

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綜述.講座

PRF的制備及保存方法的研究進(jìn)展

毛俊麗綜述，王拓，孫勇審校，陳紅亮，趙峰

富血小板纖維蛋白；制備；方法；保存

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）由法國科學(xué)家Choukroun等于2001年首次提出，與第一代富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）相比，第二代富血小板制品因其簡化的制備和血液未經(jīng)生化處理而得到廣泛應(yīng)用。骨增量術(shù)中，將PRF與骨移植材料混合，可以提高移植材料的穩(wěn)定性及骨誘導(dǎo)性，從而起到止血、促進(jìn)創(chuàng)口愈合、加速骨再生及骨改建等作用；也可以制備成膜，便于臨床使用[1]。臨床試驗(yàn)表明，富含生長因子的PRF混合骨移植材料應(yīng)用于引導(dǎo)骨再生，可以提高成骨活性[1]。但PRF制作方法研究報(bào)道較多、較雜，保存方法尚無統(tǒng)一定論，本文就PRF的制作及保存方法做一綜述。

1　PRF的制備

1.1制備原理制備PRF要求收集血液至不添加抗凝劑的試管，快速離心。由于缺乏抗凝劑，血液接觸試管表面即開始凝結(jié)，因此為了成功制備PRF，快速血液收集和在凝血反應(yīng)開始前直接離心是絕對必要的[1]。PRF制備過程同時(shí)進(jìn)行著離心反應(yīng)和凝集反應(yīng)。離心作用即在離心機(jī)強(qiáng)大的離心力作用下，使血液中血細(xì)胞的沉降加快,把血液中不同沉降速率(基于粒子的大小、形狀和密度等決定）的物質(zhì)分開,實(shí)現(xiàn)血液分層[2]；凝集反應(yīng)類似于人體生理凝血過程，依賴血液樣本含有的少量凝血酶將纖維蛋白原緩慢轉(zhuǎn)化為纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種緩慢聚合過程更符合生理凝血機(jī)制，應(yīng)用于臨床也會(huì)引起一個(gè)更高效的細(xì)胞遷移和擴(kuò)散,促進(jìn)軟硬組織愈合[3]。制備的PRF包括以下3層：上層貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)，中間層PRF凝膠，下層為紅細(xì)胞層[4]。

1.2離心方法PRF制備的關(guān)鍵是選擇離心方法，離心方法主要由相對離心力（relative centrifugal force，RCF）和離心時(shí)間決定。而相對離心力越大，離心時(shí)間越久，血液中細(xì)胞破壞可能性越大[5]。RCF被廣泛用來描述離心，它與轉(zhuǎn)速和離心半徑相關(guān)。RCF=1.118×10-6×R×W2(R為離心半徑，單位為cm；W為每分鐘轉(zhuǎn)速，單位為r/min）[6]。

最常用PRF的制取方法是Choukroun等[7]在2001年提出的，采集10 ml全血到不含抗凝劑的試管內(nèi)，立即采用3000 r/min(相對離心力大約400×g)，離心10 min。 Shahram等[8]采用的標(biāo)準(zhǔn)PRF制備方法是：采集9m l全血到不含抗凝劑的無菌玻璃涂層的塑料管，以2700 r/min離心12min；改良型富血小板纖維蛋白（advance platelet-rich fibrin，APRF）的制備方法是：采集10ml全血到不含抗凝劑的無菌純玻璃管，以1500 r/min離心14min。PRF和APRF由于離心力的不同，特定的細(xì)胞類型構(gòu)成不同。APRF應(yīng)用于引導(dǎo)骨再生有可能成為一種理想的自體細(xì)胞供體，特別是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，各種細(xì)胞相互協(xié)作，促進(jìn)傷口愈合和組織修復(fù)再生。程亞楠[2]分別采用2500 r/min（978×g)、3000 r/min（1408×g)、4000 r/min(2504×g)，離心10min，3種離心條件產(chǎn)物的纖維蛋白結(jié)構(gòu)及細(xì)胞分布無明顯差異。前兩組的PRF中白細(xì)胞和血小板回收率及部分生長因子的釋放量雖高于第3組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。李艷秋等[9]分別采用2500、3000、3000 r/min離心10 min和3000 r/min分別離心10、15、20min的6種方式制備PRF，測定每種產(chǎn)物在7 d內(nèi)TGF-β和PDGF-AB釋放含量，結(jié)果3000 r/min離心10min釋放量明顯高于其他組。

1.3離心試管Mustafa等[10]用鈦試管3500 r/min離心15 min制備T-PRF(titanium-prepared，platelet-rich fibrin)。T-PRF的血小板聚集過程和玻璃管制備的PRF相似，因其不含二氧化硅，具有更好的生物相容性。作為一種新的富血小板制品，經(jīng)過初步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其在前15 d對于結(jié)締組織形成方面具有極強(qiáng)的誘導(dǎo)再生潛力。李龍等[11]采集家兔血液，分別用塑料管和玻璃管制備PRF膜片，對比觀察7個(gè)時(shí)間點(diǎn)VEGF的濃度變化，結(jié)果用塑料管制備的PRF比用玻璃管制備的釋放VEGF含量低。

1.4除水方式血液經(jīng)離心后，除水的方式有兩種，一種方法是取出PRF凝膠靜置10 min（緩慢脫水）；另一種方法是將PRF放入到PRF專用工具盒內(nèi)，壓制成膜或者塊（快速脫水）。李艷秋[9]等將制備的PRF分別用緩慢脫水和快速脫水兩種方式處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其釋放生長因子的含量無明顯差異。生長因子及血小板鑲嵌在纖維蛋白構(gòu)成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，擠壓并不會(huì)丟失。因此，目前臨床上常采用快速脫水的方式制備PRF。

2　保存方法

PRF作為一種源自自體的生物材料，臨床上多采用新鮮制備的，其保存方法研究較少，并且尚未見有特別理想的保存方法。孫悅[12]將單純利用冷凍干燥技術(shù)處理的PRF與新鮮PRF通過掃描電鏡、降解性檢測、對細(xì)胞增殖影響等方面進(jìn)行對比觀察，發(fā)現(xiàn)凍干后的PRF結(jié)構(gòu)疏松多孔，其內(nèi)的纖維網(wǎng)狀已經(jīng)消失，部分生長因子的釋放及降解速度加快，但其生長因子的活性并無影響。將PRF放在聚碳酸1,2-丙二酯和聚琥珀酸丁二酯的共聚物膜上凍干得到的復(fù)合膜，其生長因子的釋放及降解速度較新鮮PRF減緩，這種復(fù)合凍干膜還具有支架作用，有望成為PRF保存應(yīng)用研究的新方向。為了研究PRF體外生長因子的釋放曲線，李龍等[11]將制備的PRF置于無菌DMEM培養(yǎng)基中，分別放置于4℃和37℃下培養(yǎng)，分別在7個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集析出液，保存于-20℃，測定其VEGF濃度值，得出結(jié)論4℃比37℃培養(yǎng)條件下釋放VEGF含量高。

3　小結(jié)

PRF已廣泛應(yīng)用于口腔頜面外科、口腔種植修復(fù)與牙周病等，目前大部分學(xué)者采用的人體PRF制作方法是：采集人體血液置于標(biāo)準(zhǔn)PRF無菌玻璃涂層的塑料離心管內(nèi)（不添加抗凝劑），用德國PROCESS PC-02離心機(jī)，在3000 r/min即刻離心10 min或2700 r/min即刻離心12 min；取出PRF凝膠放入PRF制備工具盒，壓制成塊或者膜。雖有報(bào)道新方法制備的血小板衍生物，如APRF、TPRF具有某些方面發(fā)展?jié)摿Γ淙杂写M(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究。由于PRF制作方法較為簡單，其蘊(yùn)含的生長因子在制作完成后1 h內(nèi)大量釋放，以及沒有很好的保存方法[2]，故建議在制作后盡早使用。

[1]Sunitha Raja V,Munirathnam Naidu E.Platelet-rich fibrin: evolution of a second-generation platelet concentrate[J].Indian J Dent Res,2008,19(1):42-46.

[2]程亞楠.三種離心方法對L-PRF生物學(xué)特性的影響[D].長沙:中南大學(xué),2013.

[3]Dohan DM,Choukroun J,Diss A,et al.Platelet-rich fibrin(PRF), a second-generation platelet concentrate.PartⅠ:technological concepts and evolution[J].Oral Surg OralMed Oral Pathol Oral Radiol Endod,2006,101(3):e37-44.

[4]Anilkumar K,Geetha A,Umasudhakar et al.Platelet-rich-fibrin: a novel root coverage approach[J].J Indian Soc Periodontol, 2009,13(1):50-54.

[5]彭玉蓮,張成,馮妙芙,等.離心力和離心時(shí)間對尿沉渣中紅細(xì)胞和白細(xì)胞成分的影響[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,32(8): 869-870.

[6]冷懷明,范華隸,張大春.正確表示相對離心力的量和單位符號的探討[J].編輯學(xué)報(bào),2003,15(4):269.

[7]Choukroun J,Adda F,Schoefflr C,et al.Une opportunitéen paro-implantologie:le PRF[J].Implantodontie,2001,42:55-62.

[8]Shahram Ghanaati,Patrick Booms,Joseph Choukroun.Advanced platelet-rich fibrin(A-PRF)-A new concept for cell-based tissue engineering by means of inflammatory cells[J].JOral Implantol, 2014,40(6):679-689.

[9]李艷秋,周延民,孫曉琳.富血小板纖維蛋白體外釋放TGF-β和PDGF-AB影響因素的探討[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2012, 26(6):404-407.

[10]Mustafa Tunali,Hakan?zdemir.In vivo evaluation of titanium-prepared platelet-rich fibrin(T-PRF):a new platelet concentrate[J].British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2013,51:438-443.

[11]李龍,趙建輝,劉斌,等.富血小板纖維蛋白體外釋放VEGF影響因素的探討[J].中國美容醫(yī)學(xué),2012,3(21):427-430.

[12]孫悅.PPC/PBS與PRF以凍干法復(fù)合后的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究[D].長春:吉林大學(xué),2013.

R 783.9

A

1004-0188（2016）03-0326-02

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.038

全軍“十二五”科研面上課題（CWS11J024）

646000四川瀘州，四川醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院（毛俊麗，王拓）；成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院口腔科(孫勇，陳紅亮，趙峰)

孫勇,E-mail:2623457656@qq.com

（2015-12-23）