吳疑，匡梅綜述，周紅，潘夕春審校

（第三軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，重慶400038）

TLR4信號通路及其負調控研究進展*

吳疑，匡梅綜述，周紅，潘夕春△審校

（第三軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，重慶400038）

受體，細胞表面；膜糖蛋白類；信號處理，計算機輔助的；信號轉導；TLR4；脂多糖；負調控

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.013

A

1009-5519（2016）18-2821-04

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是機體天然免疫系統(tǒng)中的模式識別受體，可識別不同的病原體相關分子模式（pathogen-associatedmolecular patterns，PAMPs），從而啟動相關的下游信號轉導途徑［1］。其中，TLR4相對分子質量為90×103～150×103，主要分布于巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、T/B淋巴細胞及上皮細胞，識別革蘭陰性（G-）菌的菌壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）［2-4］。TLR4為Ⅰ型跨膜受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內區(qū)組成。胞外區(qū)負責識別配體，由22個長度為20～30氨基酸殘基的亮氨酸重復序列（leucine-rich repeat，LRR）組成；跨膜區(qū)富含半胱氨酸，決定TLR4的胞膜定位；胞內區(qū)包含1個在所有TLRs中序列保守的結構域，即Toll/ IL-1受體（Toll/interleukin-1 receptor domain，TIR）結構域，可招募下游銜接蛋白從而啟動下游通路，導致腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factors α，TNF-α）、白介素6（IL-6）等炎癥因子的大量釋放［5-7］。TLR4通路與感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的發(fā)生密切相關，被認為是上述疾病的重要靶點。本文將就TLR4介導的天然免疫信號通路及其負調控的最新進展進行綜述。

1　TLR4介導的信號轉導途徑

1.1LPS誘導TLR4二聚體化LPS主要由3個部分構成：脂質A、核心多糖和O抗原多糖，其中脂質A是誘發(fā)TLR4信號轉導的主要部分。G-菌的脂質A一般含1條糖胺主鏈和5～7條脂鏈。大腸埃希菌和沙門菌的脂質A含2個磷酸基團且其?；擞?條脂鏈，研究表明這種結構比其他G-菌有更強的炎性反應活性［1，8］。脂質A的脂鏈和磷酸基團數(shù)量發(fā)生改變均可抑制TLR4二聚體化［9-10］。因此，可通過改變脂質A脂鏈和磷酸基團數(shù)量，獲得具有阻斷TLR4二聚體化活性的LPS類似物作為新型抗生素。

TLR4與髓分化蛋白2（myeloid differentiation protein 2，MD-2）形成異二聚體［1］。MD-2是分泌型糖蛋白，含1個β-折疊和2個β-片層，2個β-片層之間為結合LPS的疏水活性中心。相較于其他β-折疊類蛋白，MD-2的β-片層間無二硫鍵，因此疏水中心較易暴露。MD-2的疏水中心由大量帶正電荷基團修飾，因此易結合兩親性的或帶負電荷的配體，如LPS。MD-2只有約1/3部分與TLR4凹面結合，剩余部分結合LPS或其他配體［5］。MD-2與TLR4結合方式：TLR4胞外區(qū)N端和中心部分的電荷與MD-2表面電荷互補結合，其結合位點主要分為A、B區(qū)。A區(qū)負電荷與MD-2表面正電荷作用，B區(qū)正電荷與MD-2表面負電荷作用，此外還有氫鍵等作用參與，使二者表面緊密結合。研究表明，A、B區(qū)或親水基團突變均會影響TLR4與MD-2結合［1］。

LPS首先與血清中LPS結合蛋白（LPS-binding protein，LBP）結合，然后被轉運給CD14。CD14是LPS的高親和力受體，以分泌性蛋白的形式存在或以糖基磷脂酰肌醇形式錨定在巨噬細胞表面，將LPS聚合物分解為單分子并呈遞給TLR4∶MD-2復合物［1，9］。隨后脂質A的5條脂鏈都嵌在MD-2的疏水中心，另一條R2脂鏈則有部分位點暴露，以結合TLR4從而介導TLR4二聚體的形成，最終使LPS結合TLR4和MD-2的聚合物誘導形成“M”形2∶2∶2復合物，啟動胞內信號轉導。

1.2胞內信號轉導TLR4胞內信號通路包括髓分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴和非依賴途徑，均可通過招募下游銜接蛋白而放大刺激信號，上調炎癥基因表達［4，11］。

1.2.1MyD88依賴途徑LPS活化的TLR4二聚體可形成高度有序的多聚體，從而更易招募MyD88等銜接蛋白。MyD88包含2個信號轉導結構域：C端的TIR結構域，可與TLR、IL-1R和IL-18R的TIR結構域結合；N端的死亡結構域，負責招募下游含死亡結構域的信號分子［5］。TLR4招募MyD88需要MyD88樣受體（Mal）的參與。不同于其他含TIR結構域的銜接蛋白，Mal通過其突起的“AB loop”連接TLR4和MyD88，且其N端含磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，可與細胞膜上富含TLR4的區(qū)域連接，有利于Mal與MyD88結合［12］。

隨后MyD88招募IL-1受體相關激酶（IL-1R associated kinases，IRAKs），形成螺旋狀的MyD88-IRAK-4-IRAK-1/2復合物（Myddosome）。Myddosome由6個MyD88、4個IRAK-4和4個IRAK-1/2通過死亡結構域連接而成。該復合物形成過程：TLR4首先招募形成6～8個MyD88復合物，此復合物聚集4個IRAK-4使其自身磷酸化，最后結合4個IRAK-1/2亞基［13-14］。隨后IRAK1磷酸化并與MyD88脫離，招募并活化腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNFR-associated factor 6，TRAF6），活化的TRAF6招募轉化生長因子-β活化激酶結合蛋白抗體1/2/3（TAB1/2/3），形成轉化生長因子激酶1（TAK1）復合物［6，15］。TAK1復合物由TAK1及TAB1/2/3構成，其中TAB2介導TAK1和TRAF6的結合，TAB1使TAK1活性增強。TAK1可招募并激活核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）抑制蛋白（IκB）激酶（IκB kinase，IKK），最終作用于IκB并使其磷酸化、泛素化降解，從而導致NF-κB與IκB分離入核，啟動或增強炎癥基因的轉錄，促進炎癥因子及炎癥趨化因子如TNF-α、IL-12的表達［8，16］。TAK1也可招募促細胞分裂激活性蛋白激酶4（mitogenactivatedproteinkinase 4，MKK4），使C-JunN端激酶（JNK）磷酸化，隨后JNK激活了激活子蛋白-1（AP-1）轉錄因子，誘導促炎介質如TNF-α等的表達；TAK1還能招募MKK3和MKK6，誘導p38α活化，從而激活轉錄因子CREB和c/EBP-β，誘導炎癥趨化因子、促炎性細胞因子（IL-10，IL-12）等的表達［6］。除此之外，MyD88、IRAK-1、IRAK-4和TRAF6也可通過干擾素調節(jié)因子5（IRF5）作用，促進干擾素表達［17-18］。

1.2.2MyD88非依賴途徑研究表明，MyD88基因缺陷小鼠未完全喪失對LPS刺激的反應性，且體內IRF3的活化和干擾素-β（IFN-β）的表達均不受影響，表明TLR4信號轉導并不完全依賴于MyD88途徑［19］。TLR4也可招募誘導IFN-β含TIR結構域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF），啟動后續(xù)信號轉導。具體過程：Mal磷酸化從膜上解離，從而使LPS/MD-2/TLR4聚合物形成內體；隨后TRIF相關接頭分子（TRIF-related adaptor molecule，TRAM）介導含TLR4的內體與TRIF結合，其作用與Mal類似，但僅有當TLR4二聚體化且以內體形式存在時，TRAM才會與之連接［8，14，20-21］；隨后TRIF招募含RIP同型結構域激酶（RIP homotypic interaction motif containing kinase，RIP1），使RIP1被E3泛素化連接酶Peli1泛素化，最終與IKKγ及TAK1相互作用，通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB途徑調節(jié)炎癥基因表達。TRIF也能招募TRAF3，后者自身修飾后與激酶TBK1相互作用，使轉錄因子IRF3磷酸化并移位到核內，啟動Ⅰ型干擾素的表達［3，6，17］。

2　TLR4信號通路中的負調控因子

TLR4信號通路是天然免疫系統(tǒng)中最重要的致炎信號通路之一，是治療感染性炎癥的重要靶點。本部分從抑制TLR4表達、TLR4二聚體化及信號轉導3個不同層面，對現(xiàn)有的負調控因子研究進展進行綜述。

2.1抑制TLR4表達定量RT-PCR和熒光素酶報告基因實驗證實，let-7家族的miRNA let-7i在轉錄后水平與TLR4mRNA的3′-非翻譯區(qū)相互作用，抑制其表達［2，22］。阿托伐他汀可顯著上調miRNA let-7i從而抑制TLR4、NF-κB表達，減弱信號轉導。動脈粥樣硬化患者使用阿托伐他汀后，體內miRNA let-7i表達升高而TLR4表達降低。阿托伐他汀還可通過干擾胞膜脂筏形成，影響TLR4聚集，導致MyD88招募和通路活化受阻。臨床研究表明，阿托伐他汀和替米沙坦聯(lián)合治療可減少動脈粥樣硬化患者巨噬細胞中IRAK-1、TRAF6和TLR4的mRNA表達。該過程中TLR4不是直接靶點，這也給抗感染治療提供了一個新的思路。阿托伐他汀是廣泛應用于臨床的降脂藥，其安全性高、作用機制明確，可作為治療G-菌感染或TLR4信號通路介導的其他疾病的候選藥物［2，15，23］。

2.2抑制TLR4二聚體化單磷酰脂質A（monophosphory lipid A，MPLA）是人乳頭瘤病毒和乙型肝炎病毒疫苗的組成成分，是現(xiàn)今唯一商業(yè)化作用于TLR4途徑的疫苗佐劑。在乙型肝炎疫苗中加入MPLA，可顯著提高免疫受損患者的體內抗體濃度［8，24］。MPLA是沙門菌脂質A的衍生物，較脂質A少一個磷酸基團，其與TLR4的結合位點及形成的TLR4-MD-2二聚體結構與脂質A高度相似。但MPLA較LPS致炎活性減弱，原因可能是其缺少磷酸基團，與帶正電荷的TLR4-MD-2的親和力減弱，因而誘導二聚化的能力也相應減弱［5］。在非靈長類動物皮內注射MPLA，發(fā)現(xiàn)其能招募抗原提呈細胞，且能誘導抗原特異性T細胞擴增，因而可作為疫苗佐劑［8，25］。

姜黃素為酸性多酚類物質，是姜黃根的主要組成成分，主要在膳食和傳統(tǒng)飲食中作為添加劑使用。其在HEK-TLR4細胞中可與LPS競爭性結合MD-2，從而抑制TLR4二聚體形成，阻斷LPS/TLR4信號轉導。因而姜黃素也作為候選藥物進行研究［26］。

2.3阻斷胞內信號轉導

2.3.1作用于銜接蛋白生長停滯特異基因Gas6是一種分泌蛋白，與抗凝素蛋白氨基酸序列同源度為46%，能特異性激活TAM受體酪氨酸激酶，TAM與Ⅰ型干擾素受體（IFNR1）結合，通過IFNR1激活信號傳導及轉錄激活因子1（STAT1），活化的STAT1能促進細胞因子信號抑制物1（SH2 domain of suppressor of cytokine signaling 1，SOCS-1）和SOCS-3的表達，其中SOCS-1可以輔助Mal泛素化降解，阻斷信號轉導。實驗表明，SOCS-1轉基因小鼠對LPS沒有反應，SOCS-3可作用于TRAF3，阻斷下游信號通路［3，27］。

單核細胞受到LPS誘導后，MyD88剪接體（MyD88s）表達增加，MyD88s與MyD88競爭性結合MyD88，形成不能與IRAK-4相互作用的MyD88與MyD88s二聚體，從而抑制下游信號轉導［3］。含金結構域TRAM接頭蛋白（TAG）是TRAM的一種剪接體，存在于內質網(wǎng)和靜息細胞的早期內體中。當細胞受到LPS刺激時，TAG轉移到晚期內體中干擾TRAM與TLR4的結合，抑制Ⅰ型干擾素生成。實驗表明，TAG敲除小鼠體內TLR4降解速度減慢，表明TAG可促進TLR4降解［20，27］。

2.3.2作用于激酶IRAKsIRAKM屬于IRAK家族，但缺少其相似物IRAK-1/2和IRAK-4的激酶活性。IRAKM阻礙IRAK-1/IRAK-4與MyD88的分離，由此抑制IRAK-1與TRAF-6的結合，從而阻斷下游信號轉導［28］。

2.3.3作用于TRAFs去泛素化酶鋅指蛋白A20也稱作TNF-α誘導蛋白3（TNF-α-induced protein 3，TNFAIP3），是一個由Tnfaip基因編碼的去泛素化酶。A20特異性識別TRAF6并使其去泛素化，從而阻斷TRAF6與多聚泛素鏈的連接，抑制TLR4信號轉導［3，6，27］。

腸道細菌如大腸埃希菌和沙門菌作用于腸上皮細胞，然而盡管有TLR存在，腸上皮細胞對病原體的反應較其他細胞偏弱。其原因是腸上皮細胞表達一種負調控TLR信號轉導因子——單個抗體白介素1相關受體（single Ig IL-1 related receptor，SIGIRR），其可使IRAK與TRAF6分離，具體機制不明。SIGIRR基因缺陷小鼠感染出血性大腸埃希菌后，其腸上皮細胞擴增且致炎因子表達增多，表明SIGIRR可抑制TLR通路［29］。

酪氨酸磷酸酯酶（src-homology-region-2-domaincontaining phosphatase，SHP）可通過抑制TRAF6泛素化從而阻斷TLR4信號轉導。實驗表明，SHP敲除小鼠在LPS應答中的TNF，可使IL-1β、IL-6表達增高；骨髓來源細胞的SHP能保護SHP缺陷小鼠，防止LPS誘導休克的發(fā)生，表明SHP對TLR4通路有負調控作用。進一步研究表明，SHP生成依賴于Ca2+依賴的AMP激活蛋白激酶途徑［27］。

2.3.4作用于TLR4通路其他分子黏附/消除病原體的Ⅲ型效應蛋白轉位緊密黏附素受體（translocatedintimin receptor，Tir）可與細菌菌膜上的緊密黏附素直接結合，從而與宿主細胞的胞膜融合。其有黏附及抹平作用，也可抑制體內天然免疫應答。Tir與含免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs，ITIMs）有相似序列，這種基序在免疫抑制子中常見。Tir被分泌到宿主細胞內，其ITIM樣基序促進SHP-1的招募，使NF-κB和MAPK去磷酸化失活；其與TRAF6結合后可阻斷TRAF6多聚泛素化鏈形成及后續(xù)TAK1的激活；其在胞內以Tir-SHP-1-TRAF6復合體形式抑制NF-κB和MAPK途徑的信號轉導［3，30］。

抑制性鋅指蛋白Traid3A是有E3泛素化連接酶活性的環(huán)指蛋白，包含TIR結構域。Traid3A隨TRAF3的減少而增多，且其作用具有劑量依賴性。Traid3A過量表達促進了TLR4的降解；也可使TRAF3第48位的賴氨酸位點泛素化，導致TRAF3的構型翻轉及第396位的絲氨酸位點磷酸化，從而抑制IRF3的激活［3，20］。

3　小結

綜上所述，TLR4介導的天然免疫信號轉導分為三步：首先LPS誘導TLR4二聚體化，然后通過MyD88依賴和非依賴途徑招募銜接蛋白，最終導致核因子活化和促炎因子基因的表達。由于LPS誘導炎癥因子的過度釋放導致膿毒癥、感染性休克等危重癥的發(fā)生，LPS/TLR4通路的負調控策略成為研究熱點。根據(jù)TLR4通路的不同階段，可將現(xiàn)有負調控因子分為三類：一是TLR4表達抑制劑，如阿托伐他汀、miRNA let-7i等；二是TLR4二聚體化抑制劑，如MPLA、姜黃素等；三是TLR4通路分子抑制因子，如Gas6、Traid3A等。對上述TLR4通路負調控因子中抑制作用明顯、機制明確的分子進行體內外藥效學研究、結構改造等深入探索，有助于研發(fā)新的TLR4通路靶向藥物，為治療G-菌感染導致的感染性休克、膿毒癥，以及腫瘤、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等提供新的候選藥物。

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國家自然科學基金資助項目（81202325）。

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（2016-05-22）