韋曉群黃維龍黎海超陳俊騏陳燕芬郭慶園李菊蔡純

（廣東出入境檢驗檢疫局廣東廣州510623）

奶粉中20種磺胺類抗生素含量的外標(biāo)測定法開發(fā)

韋曉群黃維龍黎海超陳俊騏陳燕芬郭慶園李菊蔡純

（廣東出入境檢驗檢疫局廣東廣州510623）

方法基于液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法，通過優(yōu)化前處理步驟，提高方法的回收率，達(dá)到建立外標(biāo)法定量的目的。結(jié)果顯示緩沖溶液的最佳pH為6.5、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為35℃，另外只需提取2次以及無需脫脂即能達(dá)到滿意的回收率。方法的檢測限、穩(wěn)定性能滿足奶粉中磺胺類藥物的殘留檢測。

奶粉；磺胺類抗生素；外標(biāo)法

1 前言

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，具有抗菌譜廣、價格低、使用簡便、供應(yīng)充足等優(yōu)點，目前已廣泛用于奶牛傳染病的飼養(yǎng)與治療。由于SAs性質(zhì)穩(wěn)定，容易在體內(nèi)累積以及導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性、過敏、造血紊亂、致癌等，因此，歐盟規(guī)定牛奶中SAs的殘留限量為10 μg/kg，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定牛奶中SAs的殘留限量為100 μg/kg。

目前，牛奶中SAs殘留的檢測方法主要有微生物法（主要為杯碟法，CPM）、紫外可見分光光度法（UV-VIS）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜法（LC-PDA）、毛細(xì)管電泳法（CE）、薄層色譜法（TLC）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）、液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法（LC-MS/MS）[1-10]。微生物法快速、價低，但特異性差，靈敏度不高，檢出限較高；ELISA法特異性好、靈敏度高，但是存在假陽性；GC-MS/MS法需要衍生，前處理步驟繁瑣、有機(jī)試劑消耗量大；HPLC法分離困難。因而常用的方法是LC-MS/MS法，但是該方法受基質(zhì)影響大，往往需要添加同位素內(nèi)標(biāo)。本研究基于LC-MS/MS法，通過優(yōu)化前處理步驟，提高方法的回收率，達(dá)到外標(biāo)法定量的目的。方法的檢測限、穩(wěn)定性能滿足牛奶和奶粉中SAs的殘留檢測。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

混標(biāo)磺胺脒、磺胺醋酰、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲異噁唑噁唑、磺胺二甲苯、磺胺多辛、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺苯酰、磺胺異二甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺苯吡唑：由美國西格瑪公司提供。

除另有說明外，所用試劑均為分析純；實驗用水采用GB/T 6682規(guī)定的二級水。

2.1.2 儀器和設(shè)備

三重四級桿-線性離子阱質(zhì)譜儀（API4000 Q TRAP）：AB SCIEX公司，美國。

2.2 方法

2.2.1 前處理方法

稱取0.25 g（精確至0.001 g）奶粉，加入2 mL水，渦旋震蕩2 min，加入8 mL乙腈，12 000 r/min離心5 min，過濾；加入10 mL pH=6.5緩沖溶液（20 mmol/L磷酸氫二鉀溶液用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.5），震蕩2 min；再加入過量氯化鈉，離心分層；取出上層清液，再用5 mL乙腈加入到下層清液中洗滌，離心分層并提取上層清液，重復(fù)1次。合并上清液，35℃旋蒸至干，用乙腈定容至1 mL，過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣瓶中，供上機(jī)分析。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent TC C18，150 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：40℃；梯度洗脫：洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；多重反應(yīng)檢測（MRM）；電噴霧電壓：5500 V；霧化器壓力：0.065 Mpa；氣簾氣壓力：0.016 Mpa；輔助氣壓力：0.060 Mpa；離子源溫度：45℃；定性離子對、定量離子對、碰撞電壓、去簇電壓等參數(shù)見表2。

表2 定量離子參數(shù)

（續(xù)表2）

3 結(jié)果與討論

3.1 緩沖溶液pH的優(yōu)化

比較了緩沖溶液pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時對SAs（總量）回收率的影響（圖1），結(jié)果表明回收率隨著緩沖溶液pH的上升而提高，至pH為6.5時達(dá)到最高（80%），然后開始下降，因此選擇緩沖溶液的pH=6.5。

3.2 提取溶液次數(shù)對回收率的影響

比較了用乙腈提取下層溶液次數(shù)對SAs（總量）回收率的影響（圖2），結(jié)果表明提取2次回收率即可達(dá)到要求，因此樣品前處理時選擇提取2次。

3.3 考察正己烷除脂對回收率的影響

比較了是否用正己烷除脂對SAs的影響（圖3），結(jié)果表明脂質(zhì)對SAs（總量）的干擾不大，因此不用正己烷除脂。

3.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度對回收率的影響

比較了30℃、35℃、40℃、45℃4個溫度對SAs（總量）回收率的影響（圖4），結(jié)果表明在40℃以上回收率急劇下降，因而選擇35℃作用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度。

圖1 不同緩沖溶液pH下SAs（總量）的回收率

圖3 除脂前后SAs的回收率

圖2 不同提取次數(shù)SAs（總量）的回收率

圖4 不同旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度下SAs的回收率

3.5 方法的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

方法對所有SAs的檢出限為0.2μg/kg，線性范圍為2 μg/kg-100 μg/kg，定量限為2 μg/kg（S/N≥3），詳見表3，表示能滿足實際檢測需求。方法的色譜分離見圖5。

表3 檢測方法的定量限和定量范圍

圖5 SAs的色譜-質(zhì)譜圖

3.6 方法的準(zhǔn)確度

在0.5 g奶粉里添加5 μg/kg的20種混標(biāo)溶液1 mL，按制備方法制備后進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明SAs（總量）回收率為75.2%-127.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.35%-6.81%，滿足實驗要求。

表4 檢測方法的準(zhǔn)確度

（續(xù)表4）

4 結(jié)論

本研究開發(fā)了奶粉中SAs的LC-MS/MS外標(biāo)定量檢測方法，結(jié)果顯示在奶粉的乙腈水溶液中先加入pH為6.5磷酸鹽緩沖溶液后加入過量氯化鈉，并提取2次，然后在35℃進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即可得到大于80%的回收率，無需使用同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正。方法的檢測限、穩(wěn)定性能滿足奶粉中SAs的殘留檢測。

參考文獻(xiàn)

[1]HOFFRB，PIZZOLATOTM，PERALBAMCR，etal. Determinationofsulfonamideantibioticsandmetabolitesin liver，muscleandkidneysamplesbypressurizedliquid extraction or ultrasound-assisted extraction followed by liquid chromatographyquadrupolelineariontrap-tandemmass spectrometry（HPLC-QqLITMS/MS）[J].Talanta，2015，134（1）：768-778.

[2]EBRAHIMPOUR B，YAMINI Y，REZAZADEH M.A sensitive emulsification liquid phase microextraction coupled with on-line phase separation followed by HPLC for trace determination of sulfonamides in water samples[J].Environmental Monitoring and Assessment，2015，187（1）：1-13.

[3]MENGZhe，SHIZhihong，LIANGShuxuan，etal.Residues investigation of fluoroquinolones and sulphonamides and their metabolites in bovine milk by quantification and confirmation using ultra-performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry[J].Food Chemistry，2015，174：597-605.

[4]ABDALLAHH，AMAUDGUIHEMC，JABERF，etal.Multiresidue analysis of 22 sulfonamides and their metabolites in animaltissuesusingquick，easy，cheap，effective，rugged，and safe extraction and high resolution mass spectrometry（hybrid linear ion trap-Orbitrap）[J].Journal of Chromatography A，2014，1355：61-72.

[5]ZHAO Yonggang，ZHOU Lixin，PAN Shengdong，et al.Fast determination of 22 sulfonamides from chicken breast muscle using core-shell nanoring amino-functionalized superparamagnetic molecularly imprinted polymer followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2014，1345：17-28.

[6]STOREY J M，CLARK S B，JOHNSON A S，et al.Analysis of sulfonamides，trimethoprim，fluoroquinolones，quinolones，triphenylmethanedyesandmethyltestosteroneinfishand shrimpusingliquidchromatography-massspectrometry[J]. Journal of Chromatography B，2014，972（1）：38-47.

[7]ABOUFAZELI F，ZHAD H R，SADEGHI O，et al.Novel Cd（II）ion imprinted polymer coated on multiwall carbon nanotubes as a highly selective sorbent for cadmium determination in food samples[J].Journal of AOAC International，2014，97（1）：173-178.

[8]ARROYO-MANZANARES N，GáMIZ-GRACIA L，GARCíACAMPAA A M.Alternative sample treatments for the determination of sulfonamides in milk by HPLC with fluorescence detection[J]. Food Chemistry，2014，143：459-464.

[9]郭偉，劉永，劉寧，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析牛乳中24種磺胺類藥物殘留[J].分析化學(xué)，2009，37（11）：1638-1644.

[10]農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

Development of External Standard Method for the Determination of 20 Kinds of Antibiotics in Milk Powder

WEI Xiaoqun，HUANG Weilong，LI Haichao，CHEN Junqi，CHEN Yanfen，GUO Qingyuan，LI Ju，CAI Chun
（Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong，510623）

The method was developed to improve the recovery rate for achieving external standard method by optimizing the pretreatment steps based on the LC-MS/MS method.The results showed that the optimum pH of the buffer solution was 6.5，the rotary evaporation temperature was 35，which were with twice extraction and without eliminating fat.It was confirmed the detection limit and the stability of the method were satisfied for the determination of sulfonamides in milk powder.

Milk Powder；Sulfonamides；External Standard Method

S859.84

E-mail：weixq@iqtc.cn

廣東出入境檢驗檢疫局科研項目（2014GDK62）

2016-09-18