潘曉波，王雪，任雨，翁國斌

磷酸二酯酶5基因在腎癌組織中表達情況的研究

潘曉波，王雪，任雨，翁國斌

目的探討磷酸二酯酶5（PDE5）基因在腎癌組織中的表達情況。方法采用RT-qPCR和Westernblot實驗檢測45例腎癌及其癌旁組織中PDE5基因的表達水平。結(jié)果腎癌PDE5/癌旁PDE5的mRNA陽性表達相對Ct值為（1.65±0.1189），差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）；腎癌PDE5/癌旁PDE5的蛋白陽性表達的相對灰度值為（2.664±0.3419），差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。結(jié)論PDE5基因在腎癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

磷酸二酯酶5；腎腫瘤；癌

腎癌是泌尿系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤之一，目前手術(shù)切除仍是主要的治療手段。近些年分析腎癌的生物學特性，探索其治療的新途徑成為了臨床關(guān)注的熱點。有研究發(fā)現(xiàn)磷酸二酯酶5（PDE5）在某些腫瘤如結(jié)腸癌、膀胱癌及乳腺癌等腫瘤中呈強陽性表達且活性明顯增加進而調(diào)控腫瘤細胞凋亡，由此推測PDE5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。然而，PDE5在腎癌中的表達情況還不清楚，因此，本研究采用RT-qPCR、Western blot實驗研究PDE5基因在腎癌組織中的表達情況，為今后腎癌的臨床治療尋找新靶點提供理論依據(jù)。報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集寧波大學醫(yī)學院附屬鄞州醫(yī)院2011—2015年手術(shù)切除的腎癌組織45例，術(shù)前均未行放化療，標本均于術(shù)后立即取材并保存在液氮中。選取距腫瘤邊緣2 cm以上的癌旁組織作對照。其中男27例，女18例；年齡28～82歲，平均（56.99±4.98）歲；按AJCC標準進行病理分期：T1～T2 32例，T3～T4 13例；按TNM分期標準：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期16例；分化程度：高分化9例，中分化31例，低（未）分化5例；腫瘤直徑：≥4cm者19例，＜4cm者26例。

1.2檢測方法

1.2.1RT-qPCR實驗檢測PDE5mRNA在不同組織中的表達。分別取腎癌組織及癌旁組織，采用TrizolReagent試劑盒（Invitrogen，美國）提取細胞總RNA，測量RNA濃度，然后應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Toyobo，日本）進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成后的cDNA進行聚合酶鏈反應（Toyobo，日本），肌動蛋白（B-actin）作內(nèi)參對照。根據(jù)PDE5及B-actin基因序列設(shè)計引物為：PDE-5正向5’-CACACCGAATCTTGCTCTTG-3’，反向5’-TCAGAATCCTTGACAACAATGG-3’，擴增產(chǎn)物134 bp；B-actin正向5’-AATCGTGCGTGACATTAAG-3’，反向5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’，擴增產(chǎn)物178bp。定量的方法參照文獻［1］，以Ct法表示基因的表達量。

1.2.2Western blot實驗檢測PDE5蛋白在不同組織中的表達量。將腎癌組織及癌旁正常組織用組織蛋白提取液勻漿后，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，溶解于冰浴PBS緩沖液（0.lmol/LTris-HCl，pH 8.0、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1％乙基苯基聚乙二醇、0.5％脫氧膽酸鈉、0.1％SDS、0.1％蛋白酶抑制劑混合物、10mmol/LPMSF），30 min。4℃下21 000 r/min離心30min，離心收集上清液，Bradford法檢測蛋白濃度，取溶于緩沖液中的20 mg蛋白質(zhì)行12％SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜上，加入相應抗體進行免疫印記。由ECL試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）完成檢測，應用Quantity One 4.4軟件處理分析。

1.3統(tǒng)計方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組比較用檢驗，計數(shù)資料比較用2檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1PDE5 mRNA在腎癌及癌旁組織中的表達情況134 bp（PDE5）及178 bp （B-actin）處均有單一特異性條帶，134bp處的條帶腎癌組較癌旁組織組明顯（封三彩圖2A），腎癌組織中的PDE5 mRNA表達明顯高于癌旁組織（封三彩圖2B），差異有統(tǒng)計學意義（=5.323，＜0.05）。

2.2PDE5蛋白在腎癌及癌旁組織中的表達情況腎癌及癌旁組織組織內(nèi)均有PDE5蛋白表達，蛋白條帶位置為105 kDa（封三彩圖3A）。蛋白條帶灰度值分析表明，PDE5蛋白在腎癌組織中表達較癌旁組織明顯增高（封三彩圖3B），差異有統(tǒng)計學意義（=4.869，＜0.05）。

3　討論

PDE5是環(huán)核苷酸水解酶超家族的成員之一，可以特異性水解細胞內(nèi)第二信使cGMP［2］，最早從大鼠的肺中提純出來［3］，后在1993年首次被克?。?］。PDE5主要分布于大腦、陰莖海綿體、血管平滑肌細胞、肺及血小板等［5］，主要是調(diào)節(jié)平滑肌的收縮，同時在大腦內(nèi)cGMP信號傳遞上起到重要的作用［6］。

國內(nèi)外研究證實，PDE5在結(jié)腸癌、膀胱癌及乳腺癌中高表達且活性增加［7-8］，但其在人腎癌組織中的表達情況如何，目前尚未見報道。本研究顯示PDE5在腎癌組織中的表達較癌旁組織高（＜0.05），提示其可能在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)PDE5抑制劑對多種腫瘤細胞具有抑制作用，有研究發(fā)現(xiàn)PDE5在甲狀腺腫瘤中高表達，應用西地那非阻止了腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移［9-10］。Kwon等［11］報道，PDE5抑制劑提高了結(jié)腸癌細胞內(nèi)cGMP濃度，激活了下游的PKG，進而抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡。Ren等［12］通過轉(zhuǎn)染表達PDE5特異性的反義序列的載體于人腎癌OSRC2細胞，PDE5基因表達減少，促進了細胞凋亡，研究表明cGMP/PKG信號傳導通路在調(diào)節(jié)腎癌細胞的增殖和存活方面起著重要的作用。由此可見，PDE5抑制劑可以抑制細胞內(nèi)cGMP的特異性水解，提高腫瘤細胞內(nèi)濃度，激活下游PKG，使細胞增殖抑制，發(fā)揮抗凋亡作用。本研究發(fā)現(xiàn)PDE5在腎癌組織中也呈高表達，因此推測cGMP/PKG信號傳導通路在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但具體作用機制尚需研究，為進一步研究腎癌的發(fā)生發(fā)展機制提供理論依據(jù)，同時為探索腎癌治療新途徑提供實驗基礎(chǔ)。

［1］LivakKJ，SchmittgenTD.Analysisofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR andthe 2（-Delta Delta C （T）method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［2］Zhu B，Strada SJ.The novel functions of cGMP-specific phosphodiesterase 5 and itsinhibitorsincarcinomacellsandpulmonary/cardiovascular vessels［J］.Curr Top Med Chem，2007，7（4）：437-454.

［3］FrancisSH，LincolnTM，CorbinJD.Characterization o f a novel cGMP bindingproteinfromratlung［J］.JBiolChem，1980，255 （2）：620-626.

［4］McAllister-Lucas LM，Sonnenburg WK，Kadlecek A，et al.The structure obovine lung cGMP-binding，cGMP-specific，phosphodiesterase，deduced，from，cDNA，clone ［J］.JBiolChem，1993，268（268）：22863-22873.

［5］Keravis T，Lugnier C.Cyclic nucleotide phosphodiesterase（PDE）isozymes as targets of the intracellular signalling network：benefits of PDE inhibitors invarious diseases andperspectivesforfuture therapeuticdevelopments［J］.J Pharmacol，2012，165 （5）：1288-1305.

［6］Bender AT，Beavo JA.Cyclic nucleotide phosphodiestemses：molecular regulation to clinical use［J］.Pharmacol Rev，2006，58 （3）：488-520.

［7］ThompsonWJ，PiazzaGA，LiH，etal.Exisulindinductionofapoptosisinvolvesguanosine 3'，5'-cyclic monophosphate phosphodiesteraseinhibition，proteinkinaseGactivation，and attenuatedbeta-catenin［J］.CancerRes，2000，60（13）：3338-3342.

［8］Tinsley HN，Gary BD，Keeton AB，et al. InhibitionofPDE5bysulindac sulfideselectively induces apoptosis and attenuates oncogenic Wnt/beta-catenin-mediated transcriptioninhumanbreasttumorcells［J］.CancerPrevRes（Phila），2011，4（8）：1275-1284.

［9］Tinsley HN，Gary BD，Keeton AB，et a1. Sulindac sulfidese-lectively inhibits growth andinducesapoptosisofhumanbreas tumor cells by phosphodiesterase 5 inhibition.elevationofcyclicGMP，andactivationofproteinkinase G［J］.Mol Cancer ther，2009，8（12）：3331-3340.

［10］SponzielloM，Verrienti A，Rosignolo F，et a1.PDE5expressioninhumanthyroidtumors and effects of PDE5 inhibitors on growthandmigrationofcancercells［J］.Endocrine，2015，50（2）：434-441.

［11］Kwon IK，Wang R，Thangaraju M，et al. PKG inhibits TCF signaling in colon cancer cellsbyblocking beta-catenin expression andactivatingFOXO4［J］.Oncogene，2010，29（23）：3423-3434.

［12］RenY，ZhengJ，YaoX，etal.Essentialrole ofthecGMP/PKGsignalingpathwayinregulatingtheproliferationandsurvivalofhuman renalcarcinomacells［J］.International Journal ofMolecularMedicine2014，32（1/2）：293-294.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.009

R737.11

A

1671-0800（2016）08-0997-02

2016-01-25

（本文編輯：孫海兒）

315040寧波，寧波大學醫(yī)學院附屬鄞州醫(yī)院

潘曉波，Email：179571095 @qq.com