文│李宏娟 張嘉楠 曹秀梅 林艷青 杜順豐（河北省秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心）

貉肉中金剛烷胺殘留的檢測方法

文│李宏娟 張嘉楠 曹秀梅 林艷青 杜順豐（河北省秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心）

項目名稱：河北省秦皇島市科技局項目（項目編號為：201502A 049）

金剛烷胺又叫三環(huán)癸胺、三環(huán)葵胺、鹽酸金剛烷胺，是國際醫(yī)學界公認的對流感病毒有抑制作用的抗病毒藥物，我國從20世紀90年代末開始在獸醫(yī)臨床上用于動物病毒病的預防和治療，但是金剛烷胺作為抗病毒藥用于獸醫(yī)臨床缺乏科學規(guī)范、安全有效的實驗數(shù)據(jù)。

金剛烷胺用于治療流感能使流感病毒發(fā)生變異，并使疫情進一步蔓延，造成抗金剛烷胺病毒的流行，對公共衛(wèi)生安全造成極大威脅。同時，金剛烷胺比較明顯的副作用是用藥后產(chǎn)生嘔吐以及神經(jīng)癥狀，而且其在體內(nèi)降解代謝的量極微。若長期食用殘留量高或被此類藥物污染的食品，會在人體積累，導致蓄積中毒，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響。因此，2005年農(nóng)業(yè)部第560號公告和農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]33號文，規(guī)定禁止金剛烷胺等抗病毒獸藥生產(chǎn)、經(jīng)營和使用。

河北省秦皇島市昌黎縣被譽為“中國養(yǎng)貉之鄉(xiāng)”，每年貉出欄量可達1100萬只。貉的用途一直以毛皮為主，貉胴體現(xiàn)多被廢棄或加工成人工飼料。據(jù)李時珍《本草綱目》記載：“貉肉甘溫無毒，主治元臟虛澇及女子疲憊?！睋?jù)報道，貉肉營養(yǎng)成分比較高，蛋白含量高于福建豬肉，脂肪低于北京豬、牛、羊肉，膽固醇含量低于豬肉、羊肉和兔肉，蛋白生物價E/T比值接近于牛肉，有很高的食用價值。所以對貉肉的可食性加以開發(fā)利用，不僅可以增加肉食來源，而且還可以增加養(yǎng)貉業(yè)的收入，促進養(yǎng)貉業(yè)的發(fā)展。

建立貉肉中金剛烷胺殘留檢測方法，對有效監(jiān)控該藥在貉的養(yǎng)殖中的應用、推廣貉肉食用的食品安全性具有重要意義。目前動物源性食品中金剛烷胺的殘留檢測，國內(nèi)外尚無法定檢測標準。本文采用甲醇-三氯乙酸提取、MCX小柱凈化，BEH C18色譜柱分離后，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對金剛烷胺進行檢測。該方法快速、科學、靈敏、可靠，用于實際樣品的檢測，結(jié)果滿意。

一、實驗部分

1.儀器與試劑。UPLC-Xevo TQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司），高速冷凍離心機，氮空吹掃描儀，Oasis MCX固相萃取小柱（3毫升/6毫克），甲醇、甲酸、乙腈（色譜級，進口），異丙醇，三氯乙酸，乙腈，濃氨水，鹽酸金剛烷胺對照品（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。

2.標準溶液的配制。標準儲備液：準確稱取鹽酸金剛烷胺0.005克于50毫升容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為100微克/毫升的標準儲備液，于4℃下避光儲存3個月。

標準中間液：精密吸取上述儲備液0.5毫升于50毫升容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.0微克/毫升的標準工作液，于4℃下避光儲存1個月。

3.樣品提取和凈化。提?。悍Q取2.0克均質(zhì)貉肉樣品于50毫升離心管中，加入10毫升1%三氯乙酸-甲醇（1∶1，v/v）提取液，充分渦旋混勻1分鐘，4℃下10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；轉(zhuǎn)移上清液至新的50毫升離心管，加入10毫升正己烷，混勻，10000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，除去上層，取下層5毫升凈化。

凈化：MCX小柱分別用3毫升甲醇、3毫升水活化；5毫升樣品過柱；3毫升2%甲酸水、3毫升100%甲醇淋洗，抽干；3毫升5%氨化甲醇∶異丙醇（4∶1）洗脫。收集洗脫液，45℃水浴氮氣吹干。1毫升0.1%甲酸水∶乙腈（9∶1）溶解定容，0.22微米濾膜過濾，濾液供UPLC-MS-MS分析。

4.色譜條件。色譜柱：UPLC BEH C18色譜柱（100×2.1毫米，1.7微米，美國Waters公司）。

流動相A：乙腈；流動相B： 0.1%甲酸水溶液；流速：0.3毫升/分鐘；柱溫：40℃；進樣量：5微升；運行時間：6分鐘。梯度洗脫見表1。

5.質(zhì)譜條件。電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓：3.5千伏；霧化氣溫度：400℃；駐留時間（Dwell time）：0.161秒；監(jiān)測離子對、錐孔電壓（Cone）和碰撞能量（Collision）等參數(shù)見表2。

二、結(jié)果與討論

1.提取溶劑的選擇。本文考察了0.5%三氯乙酸-乙腈（1∶1、v/ v）、1.0%三氯乙酸-乙腈（1∶1、v/ v ）、0.5%三氯乙酸-甲醇（1∶1、v/ v）、1.0%三氯乙酸-甲醇（1∶1、v/ v）四種溶劑。

實驗結(jié)果表明，1.0%的三氯乙酸-甲醇和1.0%的三氯乙酸-乙腈提取液沉淀蛋白的能力明顯優(yōu)于0.5%三氯乙酸-乙腈和0.5%三氯乙酸-甲醇提取液，由于1.0%的三氯乙酸為提取液提供了更好的酸性環(huán)境，更有助于目標物在MCX固相萃取小柱上附著，所以含有1.0%的三氯乙酸的提取液的回收率（80%左右）也高于含有0.5%的三氯乙酸的提取液（60%左右）。1.0%的三氯乙酸-甲醇與1.0%的三氯乙酸-乙腈回收率差別不明顯，但是1.0%的三氯乙酸-甲醇混合溶液作為提取液，提取后的溶液更澄清，而且甲醇的價格比乙腈低廉、生物毒性也低于乙腈，所以選擇1.0%的三氯乙酸-甲醇作為貉肉組織中金剛烷胺的提取溶劑。

表1 金剛烷胺洗脫梯度

表2 金剛烷胺多反應監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

為了降低基質(zhì)干擾、富集目標物、提高檢測靈敏度，本研究采用固相萃取凈化法，比較了 Waters Oasis HLB（3毫升/60毫克）、Waters Oasis MCX（3毫升/60毫克)、Waters Oasis MAX（3毫升/60毫克）、CNWBOND SCX（500毫克，3毫升）和傳統(tǒng)的C18小柱的凈化效果。結(jié)果表明 ，金剛烷胺在傳統(tǒng)C18 小柱上幾乎無回收，在Waters Oasis MCX、Waters Oasis HLB、Waters Oasis MAX和CNWBOND SCX小柱上均有不同程度的回收，其中Waters Oasis MCX 的回收率均最高。最終實驗選擇采用Waters Oasis MCX（3毫升/60毫克）固相萃取小柱凈化樣品 。

2.液相條件的優(yōu)化。本實驗選擇Waters UPLC BEH C18色譜柱、0.1%甲酸水和乙腈為流動相對金剛烷胺進行分離，通過調(diào)節(jié)流動相比例，發(fā)現(xiàn)相同濃度樣品采用梯度洗脫比等度洗脫的響應提高2倍以上。而且梯度洗脫中，在金剛烷胺出峰后流動相保持60%乙腈沖洗色譜柱1分鐘然后逐漸降到初始濃度，可以充分洗脫出色譜柱中殘留的大分子蛋白，避免了長期使用時雜質(zhì)在色譜柱中產(chǎn)生沉淀積累，影響分離效果。柱溫箱溫度選擇40℃，可以避免環(huán)境溫度對柱溫的影響導致保留時間的波動，保證保留時間的穩(wěn)定。

3.質(zhì)譜條件的優(yōu)化。由于金剛烷胺含有氨基，容易得到H+而形成穩(wěn)定的[M+]+準分子離子，因而選擇ESI正離子方法進行監(jiān)測。將500納克/毫升的標準溶液以流動注射的方式在正離子模式下進行母離子掃描，確定金剛烷胺的分子離子m/z 151.93。 然后對其子離子進行全掃描，碎片離子主要為m/z 135.04、m/z 93.01。因為m/z 135.04信號強且較為穩(wěn)定，故以135.04為定量離子。

駐留時間（dwell time）影響檢測的精確度和靈敏度。當調(diào)節(jié)駐留時間為0.161秒時，得到的離子的準確度高，重現(xiàn)性好，峰形明顯變好。

4.液相色譜線性考察及添加回收試驗。

（1）標準曲線。分別配制鹽酸金剛烷胺質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50微克/升的系列混合標準溶液，在選定的色譜質(zhì)譜條件下進行測定，以定量離子的峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸計算，在0.1～50微克/升的范圍內(nèi)標準曲線方程為Y=2757.67X+54.1375，線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)r2為0.999，詳見圖1。

（2）回收率和精密度。貉子肉中添加不同濃度的鹽酸金剛烷胺，前處理后由高至低檢測，在保證同時分離出定量離子和定性離子的前提下， 確定貉子肉中鹽酸金剛烷胺的檢出限為0.2微克/千克， 定量限為0.5微克/千克。

貉肉的添加回收和精密度試驗，添加水平為 0.5、1.0、2.0微克/千克，每個添加濃度重復三次試驗，添加、混合后靜置使樣品溶液被樣品充分吸收。然后按照本方法進行樣品處理和測定，每個添加樣品測定6次，結(jié)果陽性添加樣品的回收率在75%～91%，平均回收率在81.8%～86.9%，精密度在1.9%～3.5%（見表3）。各特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2～圖4。

表3 貉肉中鹽酸金剛烷胺的回收率和精密度

三、結(jié)論

本文建立貉肉中鹽酸金剛烷胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。貉肉樣品經(jīng)1%三氯乙酸-甲醇（1∶1, v/ v）提取，經(jīng)固相萃取柱凈化、濃縮后, 采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在正離子模式下檢測金剛烷胺。本實驗采用外標法進行定量, 方法檢測限為0.2微克/千克，定量限 0.5微克/千克，金剛烷胺平均回收率為81.8%～86.9%，相對標準偏差為 1.9%～3.5%（n=3）。本方法靈敏度高、準確性好、適用于貉肉中金剛烷胺殘留的檢測。

◎圖1 檢驗方法校準曲線

◎圖2 鹽酸金剛烷胺標準品MRM色譜圖（2.0微克/千克）

◎圖3 空白貉肉中金剛烷胺MRM色譜圖

◎圖4 空白貉肉中添加鹽酸金剛烷胺MRM色譜圖（2.0微克/千克）