袁慧坤 袁文華 刁新平

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

抗菌肽的分離純化研究進(jìn)展

袁慧坤 袁文華 刁新平

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

抗菌肽是抗生素的替代選擇之一，具有較高的抗菌活性和與抗生素不同的作用機(jī)制，不易產(chǎn)生耐藥性。但是，天然抗菌肽的提取存在成本高、操作繁瑣等缺點(diǎn)，因此需要加強(qiáng)對新型抗菌肽的研究。本文主要對天然抗菌肽的優(yōu)勢、分離和純化步驟進(jìn)行綜述。

抗菌肽；分離純化；結(jié)構(gòu)測定

自1972-1975年從果蠅及惜古比天蠶中分離出天蠶素（Cecropin）以來，抗菌肽便受到廣泛的關(guān)注。抗菌肽（Antimicrobial Peptide）又被稱為肽抗生素（Peptide Antibiotics）?？咕牡膩碓磸V泛，大多數(shù)生物體的自然防御系統(tǒng)內(nèi)均含有抗菌肽?？咕膶τ谝呀?jīng)產(chǎn)生抗生素耐藥性的細(xì)菌具有有效的抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，所以抗菌肽成為具有極大研究潛力的物質(zhì)。

1 抗菌肽的抗菌優(yōu)勢

抗菌肽擁有的與傳統(tǒng)型抗生素不同的抗菌機(jī)制，使得抗菌肽具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗寄生蟲等病原體活性高和靶向點(diǎn)多、耐藥性低等優(yōu)勢。抗菌肽的肽鏈長度相對較短，一般為15～50個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其分子量小，更易于快速到達(dá)感染部位。另外，抗菌肽可以不同功能類型聯(lián)合使用或與抗生素互相聯(lián)合發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。

2 抗菌肽的分離純化與結(jié)構(gòu)測定

分離純化是天然抗菌肽獲取過程中的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)，是進(jìn)一步對抗菌肽的人工合成與機(jī)理研究的基礎(chǔ)步驟。分離純化的過程復(fù)雜，對于未知成分和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗菌肽，其難度更大。分離純化的關(guān)鍵在于既要保持抗菌肽的生物活性，又要得到純的單一活性的肽。所以，在分離純化階段每操作一步都要對其抗菌活性進(jìn)行檢測，只有具備抗菌活性，才有必要進(jìn)行接下來的試驗(yàn)，從而得到理想的單一活性肽。

2.1 純化前處理

在分離純化步驟前，要注意對樣品的前處理：若抗菌肽存在于體積偏大的有機(jī)體內(nèi)的組織或器官，應(yīng)在提取前將其按照不同組織或器官分類；若抗菌肽存在于機(jī)體偏小至難分割狀態(tài)時(shí)，要使整個(gè)機(jī)體作為提取的對象。同時(shí)，要注意對干燥溫度、儲(chǔ)藏時(shí)間等因素的調(diào)控，以防對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.2 分離純化

2.2.1 分離純化的步驟?？咕牡姆蛛x純化基本都是根據(jù)抗菌肽的兩親性、帶正電荷和分子量小的特性進(jìn)行。另外，抗菌肽的純度與上樣量和層析柱等均有關(guān)系。目前的分離純化步驟可歸納為以下3步［1］：①使用高速離心或者超濾的方法除去樣品中的大分子蛋白質(zhì)、脂肪和顆粒物；②使用分子篩、固相萃取、離子交換色譜等方法去除部分較大分子蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽和脂肪等干擾物，進(jìn)一步分離提取得到分子量比之更小的成分；③將濾液通過陽離子交換層析、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分離純化活性物質(zhì)。

2.2.2 分離純化的方法?？咕牡姆蛛x純化方法主要有：依據(jù)溶解性能差別分離，可將其分為低溫有機(jī)溶劑沉淀、鹽析法等；根據(jù)分子大小的不同分離，可將其分為超濾、透析和凝膠過濾等；根據(jù)配體特異性分離，如親和層析法［2］等。研究表明，大部分的分離純化是根據(jù)多肽類的理化性質(zhì)而采用多級(jí)純化方法和多種分離方法結(jié)合使用。陳玉清等［3］通過Sephadex G-100凝膠過濾層析和CM-Sepharose CL-6G離子交換層析及HPLC分離，在家蠶幼蟲免疫血淋巴內(nèi)分離出2種抗菌蛋白。

2.3 抗菌肽結(jié)構(gòu)測定方法

2.3.1 非質(zhì)譜技術(shù)。如今，N端測序法是應(yīng)用于氨基酸序列的主要測定方法。雖然N端測序法已被廣泛應(yīng)用于氨基酸測序中，但存在一個(gè)弊端，就是位于N端的多肽或蛋白質(zhì)無法被測定。此時(shí)，可以使用脫修飾反應(yīng)，使得N端的氨基酸序列暴露出來進(jìn)行測定。而且，Edman降解是N端測定法的基礎(chǔ)，較小的肽段是無法被Edman講解法測定出全序列的。所以，其靈敏度較低，不適合應(yīng)用于高通量分析中。

2.3.2 質(zhì)譜技術(shù)。近年來，質(zhì)譜技術(shù)飛速發(fā)展，針對分子量相對較小的蛋白開發(fā)出了4種測定技術(shù)：電噴霧、離子體解吸、基質(zhì)輔助激光解吸／電離和快原子轟擊。而納升電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)，使得測定微量蛋白質(zhì)的領(lǐng)域得到巨大提升。電噴霧質(zhì)譜測度的原理是肽段通過與惰性氣體不斷碰撞，誘導(dǎo)分裂而衍生出的一系列碎片離子，通過他們的質(zhì)量差推斷所需測定的氨基酸序列。納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜就是安裝一系列納升噴霧源在四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Q-TOF2）上，該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以使翻譯后的氨基酸純度及修飾不能夠制約抗菌肽的序列測定。使離子阱電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜或三四級(jí)電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜與其比較可知，四級(jí)桿-飛行時(shí)間電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（QTOF-ESI-Ms/Ms）的靈敏度和分辨率要高一些，質(zhì)量測定的準(zhǔn)確度同樣較高。所以，四級(jí)桿-飛行時(shí)間電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜更佳適用于抗菌肽的測序，更有益于獲得準(zhǔn)確度高的數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜軟電離技術(shù)在進(jìn)行蛋白質(zhì)測定時(shí)，所產(chǎn)生分子相對穩(wěn)定，方法有效，因此受到眾多領(lǐng)域的重視，不僅在蛋白質(zhì)序列測定上，還在有機(jī)化學(xué)、藥學(xué)和高分子化學(xué)上發(fā)揮巨大潛力，成為眾多研究學(xué)者分析分子純度、質(zhì)量的有效工具。

3 展望

天然抗菌肽針對致病菌的入侵和免疫功能的調(diào)節(jié)均有顯著功效，并且其廣譜抗細(xì)菌、無免疫源性和分子量小等功效均有待開發(fā)，其毒副作用等無明確闡述，仍需要不斷優(yōu)化抗菌肽的分離提純等技術(shù)，不斷加深對抗菌肽的研究和探索。

抗菌肽在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥方面表現(xiàn)出很大的潛力價(jià)值，但若是將其投入畜牧業(yè)，開始大規(guī)模生產(chǎn)仍存在很多待解決的問題，如從自然物質(zhì)中提取抗菌肽是一個(gè)相對來講比較復(fù)雜的過程，來源受限，分離純化步驟繁瑣，投入高是回報(bào)率低。所以，想要讓抗菌肽更廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，仍需要進(jìn)一步研究其副作用、相互作用及各個(gè)環(huán)節(jié)。

［1］苗建銀，柯暢，郭浩賢，等.抗菌肽的提取分離及抑菌機(jī)理研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代食品科技，2014（13）：203-240.

［2］韓金玉，那平，元英進(jìn).親和色譜純化蛋白質(zhì)新進(jìn)展［J］.色譜，1996（6）：447.

［3］陳玉清，李保存，吳希，等.家蠶抗菌蛋白Cecropin D和Lysozyme的分離純化及性質(zhì)鑒定［J］.南京師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006（3）：103-107.

TS201.2

A

1674-7909（2016）36-43-2

袁慧坤（1993-），女，碩士，研究方向：動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。

刁新平，副教授，碩士生導(dǎo)師。