師 萱 閻 語 梁旭明 譚紅軍 楊 勇 鐘 耕 石文娟

(1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065； 2. 西南大學食品科學學院，重慶 400716；3. 銀耳營養(yǎng)食品企業(yè)工程技術研究中心，重慶 409000)

銀耳菌糠黑色素微波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

師 萱1閻 語2梁旭明1譚紅軍1楊 勇1鐘 耕2石文娟3

(1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065； 2. 西南大學食品科學學院，重慶 400716；3. 銀耳營養(yǎng)食品企業(yè)工程技術研究中心，重慶 409000)

銀耳菌糠；黑色素；微波；分離純化；光譜特性；抗氧化活性

黑色素(Melanins)是目前已知生物色素中含量最多、分布最廣的一類色素，廣泛存在于動植物和微生物中[1-2]。它由酚類和/或吲哚聚合物聚合而成，一般難溶于水、酸和有機溶劑，易溶于堿溶液[3]，具有抗氧化[4-6]、抗癌[7]、抗蛇(蝎、蝙蝠)毒[8]、抗病毒[9-10]、抗輻射[11]等作用，在醫(yī)學、藥學、日用化工、食品及其它領域有很大的應用潛力。

隨著銀耳生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化、工廠化的蓬勃發(fā)展，中國每年產(chǎn)生的大量銀耳菌糠不但得不到合理的利用，還造成環(huán)境污染，同時也造成資源極大浪費[12]。2014年，中國銀耳產(chǎn)量達到39.5萬t，消費量也達到38萬t，每生產(chǎn)1 kg的食用菌，大約可產(chǎn)生5 kg的菌糠[13]，因此如何正確處理和綜合利用銀耳栽培廢料有待于深入開發(fā)和研究。銀耳栽培過程中存在一種“伴生菌”香灰菌，當菌絲生長到一定階段后會產(chǎn)生大量黑色素。天然黑色素由于其來源的多樣性和復雜性給提純帶來一定困難[14]，而且因提純方法不同黑色素性質也有所不同。目前，僅有一篇專利報道[15]銀耳菌糠黑色素常規(guī)提取、高溫高壓提取、超聲輔助提取方法研究，但未見微波輔助提純研究以及對所提銀耳菌糠黑色素性能分析的報道，其方法存在提取時間長、溶劑耗量大、能源消耗高等不足。

微波輔助提取黑色素方法具有溶劑耗量較少、安全、污染小、提取率高等優(yōu)點[16-17]。本試驗擬通過單因素試驗與正交試驗設計法對銀耳菌糠黑色素微波輔助提取工藝進行優(yōu)化，并對黑色素進行初步純化、結構鑒定和體外抗氧化活性研究，以期為銀耳菌糠功能活性的深入研究、增值利用和產(chǎn)業(yè)化應用提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

銀耳菌糠：重慶黔江朵朵潤爾營養(yǎng)食品股份有限公司，于低溫避光通風處保存?zhèn)溆茫?/p>

溴化鉀：色譜純，成都西亞試劑有限公司；

鄰二氮菲和連苯三酚：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

DPPH(2，2-二苯基-1-苦基肼)：分析純，上海華藍化學科技有限公司；

七水合硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外—可見光分光光度計：UV-2450型，日本Shimadzu公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市富華儀器有限公司；

真空冷凍干燥機：FD-1型，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Spectrum GX型，美國Perkin-Elmer公司；

電子分析天平：FA2004A型，上海恒平科學儀器有限公司；

pH計：PHS-3C型，上海盛磁儀器有限公司；

微波快速制樣系統(tǒng)：MSA-II型，上海新儀公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌糠黑色素色價的測定 精確稱取菌糠黑色素粗品0.100 0 g，溶于pH 8的NaOH緩沖溶液中，并定容至100 mL，搖勻。從中吸取5 mL黑色素溶液，用同樣的緩沖溶液定容至100 mL，在最大吸收波長209 nm下測定其吸光度[18]。黑色素的色價值按式(1)計算：

(1)

式中：

A——吸光度；

m——樣品質量，g；

r——測定吸光度時所吸取樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.2 提取工藝單因素試驗

(1) 料液比對菌糠黑色素提取效果的影響：稱取粉碎后的菌糠5.00 g于燒杯中，用1 mol/L的氫氧化鈉溶液分別按料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50(g/mL)加入。60 ℃ 水浴浸提2 h。微波功率320 W，處理時間60 s。4 000 r/min 離心10 min并過濾。濾液用1 mol/L鹽酸調pH為2使黑色素沉降，4 000 r/min離心15 min得沉淀[19]。沉淀用蒸餾水洗滌，放真空干燥箱40 ℃干燥。測定計算黑色素色價。

(2) 堿液濃度對菌糠黑色素提取效果的影響：稱取粉碎后的菌糠5.00 g于燒杯中，分別用0.00，0.50，1.00，1.50，2.00 mol/L 的氫氧化鈉溶液按料液比1∶40(g/mL)加入，后續(xù)處理同1.2.2(1)。

(3) 水解時間對菌糠黑色素提取效果的影響：稱取粉碎后的菌糠5.00 g于燒杯中， 按料液比1∶40(g/mL)加入1 mol/L 的氫氧化鈉溶液。分別于60 ℃水浴浸提1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，后續(xù)處理同1.2.2(1)。

(4) 微波處理時間對菌糠黑色素提取效果的影響：稱取粉碎后的菌糠5.00 g于燒杯中，按料液比1∶30(g/mL)加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液。60 ℃水浴浸提2 h。于微波功率320 W下，分別處理0，30，60，90，120 s。后續(xù)處理同1.2.2(1)。1.2.3 正交試驗 系統(tǒng)考查提取工藝參數(shù)對提取結果的影響，根據(jù)單因素試驗結果，選取因素的不同水平，以黑色素色價為評價指標，采用L9(34)正交進行正交試驗確定最佳提取工藝。

1.2.4 銀耳菌糠黑色素的純化 參考文獻[14]和[20]，并略有修改。準確稱取5.0 g黑色素粗提物，放入燒杯并加入7 moL/L HCl 50 mL，于60 ℃水浴處理3 h后(用保鮮膜將燒杯口密封，以解決溶劑減少可能會帶來的影響)，4 000 r/min離心沉淀15 min，沉淀物用蒸餾水洗滌3次，溶于pH 8.0的氫氧化鈉溶液。加入1倍體積的氯仿異戊醇(1∶5)混合，經(jīng)多次振蕩后離心，收集上層液體，重復操作3次。用1 mol/L鹽酸將所收集液體pH調至2.0，同上離心，沉淀物依次用無水乙醇、95%濃度乙醇、75%乙醇洗滌3次，再次同上離心收集沉淀。沉淀物經(jīng)蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥，存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.5 銀耳菌糠黑色素的光譜特征分析

(1) 紫外—可見光譜掃描：稱取少量純化黑色素溶于0.01 mol/L 氫氧化鈉溶液中，超聲波輔助溶解，取波長190～550 nm處進行紫外—可見光譜掃描[21]。

(2) 傅里葉紅外變換光譜掃描：采用溴化鉀壓片法。黑色素和溴化鉀按1∶20的質量比例混勻，研成細粉，壓片。在500～4 000 cm-1范圍內測定其紅外吸收光譜[22]。

1.2.6 銀耳菌糠黑色素抗氧化活性研究

(1) DPPH自由基清除能力：根據(jù)文獻[23]，修改如下：取一定濃度(0.1～2.0 mg/mL)的樣品甲醇溶液3 mL，加入5 mL 6.34×15 mol/L DPPH·乙醇溶液，混勻后在室溫下靜置30 min，測定517 nm處的吸光值A。DPPH自由基清除率按式(2)計算：

(2)

式中：

R——清除率，%；

A0——空白在 517 nm 處的吸光度；

A1——樣品在 517 nm 處的吸光度。

2 結果與分析

2.1 銀耳菌糠黑色素提取單因素試驗結果

2.1.1 料液比對銀耳菌糠黑色素提取效果的影響 由圖1可知，隨著提取料液比增大，黑色素色價也隨之升高，并在料液比為1∶40(g/mL)時達到最大，這是因為隨著提取溶劑使用量的增大，銀耳菌糠中黑色素完全被濕潤，提取溶劑促使黑色素溶解飽和。若提取溶劑量過大，將會產(chǎn)生過多的雜質，影響下一步的酸沉，同時可能造成不必要的浪費。因此，初步選定料液比1∶40(g/mL)。

不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(n=3)

2.1.2 堿液濃度對銀耳菌糠黑色素提取效果的影響 由圖2可知，隨著提取溶劑堿液的增加，黑色素色價增加到一定值后增速緩慢，在1.5 mol/L達到最大，但考慮到黑色素因提取堿液濃度增大繼而溶出雜質越多，甚至引發(fā)黑色素與別的物質反應，同時堿液濃度過大不利于下一步的酸沉和純化，因此，初步選定堿液濃度為1.5 mol/L。

不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(n=3)

2.1.3 水解時間對銀耳菌糠黑色素提取效果的影響 由圖3可知，隨著水解時間的延長，黑色素色價逐漸增大，水解時間為2.5 h時黑色素色價達到最高，但水解時間2.0～2.5 h黑色素色價變化不明顯，隨之黑色素色價值降低，可能在水解過程中改變了黑色素的化學結構[25]，導致黑色素色價值下降。雖然水解時間2.0～2.5 h時黑色素色價值差異不顯著，但也存在緩慢的增長趨勢，因此，初步選定水解時間為2.5 h。

不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(n=3)

2.1.4 微波處理時間對銀耳菌糠黑色素提取效果的影響

由圖4可知，隨著微波處理時間的增加，黑色素色價呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在60 s時達到最大，并隨著微波處理時間的延長，黑色素色價呈現(xiàn)明顯的降低趨勢。這可能是較長時間的微波處理導致溫度升高，破壞了黑色素成分。因此，初步選定微波處理時間為60 s。

不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(n=3)

2.2 銀耳菌糠黑色素提取工藝優(yōu)化的正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結果，選取影響黑色素提取效果的因素水平做正交試驗，并對結果進行極差分析，以確定最佳的提取條件。采用L9(34)正交表，以料液比、堿液濃度、水解時間、微波處理時間作為4個考察因素，選取3個水平(見表1)進行試驗。按表1 的正交因子水平設計L9(34)正交試驗，結果見表2。由表2可知，各因素對銀耳菌糠黑色素提取效果的影響程度順序為：堿液濃度>料液比>水解時間>微波處理時間，最優(yōu)的因素水平組合為A3B3C3D2。為了確定正交試驗最佳組合的再現(xiàn)性，進行最佳組合的平行驗證實驗，即料液比1∶45(g/mL)，氫氧化鈉濃度1.75 mol/L，水解時間3 h，微波處理時間60 s，此條件下黑色素的平均色價為153.5。與正交試驗6號測得的黑色素色價的組合156.6相比，最佳的提取條件所得黑色素的色價較低。這說明在優(yōu)化的同等試驗條件下料液比過大和水解時間過長時，反而影響銀耳菌糠中提取效果，致使黑色素的色價值更低，可能是因為用堿液作溶劑提取黑色素的過程其實也是一個化學過程，當堿液濃度和水解時間適宜時，可以獲得較多黑色素，但當堿液濃度過大和水解時間過長時，可能會出現(xiàn)更多的雜質或者引發(fā)黑色素與別的物質反應，與陳松等[26]試驗結論相一致，同時與單因素試驗結論相吻合。因此，銀耳菌糠黑色素最好的提取條件為料液比1∶40(g/mL)，氫氧化鈉濃度1.75 mol/L，水解時間2 h，微波處理時間60 s。

表1 正交試驗因素水平表

表2 L9(34)正交試驗結果

2.3 銀耳菌糠黑色素純化及其結構分析

2.3.1 黑色素純化 經(jīng)分離純化后的黑色素呈深黑色，無定形粉末，帶有金屬光澤。純化后黑色素的色價為316.0，是純化前的200%，表明純化后黑色素的色價有了很大提高。

2.3.2 黑色素的紫外—可見光譜特征 由圖5可知，黑色素在紫外光區(qū)有著較強的吸收，290～295 nm范圍內有最大特征吸收峰。從最大吸收峰位置開始，隨著波長的逐漸增大，吸光度呈下降趨勢，是典型的黑色素紫外吸收圖像，與P Manivasagan等[27]報道的黑色素紫外掃描圖是一致的。

2.3.3 黑色素的紅外光譜特征 黑色素是一種生物大分子物質，其紅外光譜是由多種官能團振動所形成的寬而強吸收峰，相對缺乏官能團特征性。由圖6可知，銀耳菌糠黑色素在1 617.90，1 514.39 cm-1附近有較強的吸收峰，是由芳環(huán)骨架振動引起，在860～650 cm-1范圍內的吸收帶變弱，是由于芳環(huán)被取代并形成共扼體系，芳氫隨之相對減少；在3 250.66 cm-1附近存在較寬較強共扼吸收峰，可能是—OH和—NH之間的氫鍵連接及基團伸縮振動引起，說明分子中含有羥基(—OH)和氨基(—NH)結構；在1 650～1 710 cm-1的較強吸收峰，說明分子中有羧基(—COO)結構，3 400 cm-1處的強吸收峰，與大量的芳環(huán)基團(C═O，C═C)的振動有關，說明羧酸根(—COOH)官能團的存在[19,28]。從紅外譜圖類似性的官能團初步推斷銀耳菌糠黑色素歸為3，4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)類的黑色素。

圖5 黑色素的紫外—可見光譜圖

圖6 黑色素紅外掃描圖譜

2.4 黑色素抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基的清除能力 由圖7可知，提純的黑色素對DPPH自由基的清除能力隨濃度升高而增強，黑色素濃度與DPPH自由基清除率的線性回歸方程為：y=23.84x+8.424，r2=0.997，通過計算，得出該黑色素對DPPH自由基的半抑制濃度(IC50)為1.74 mg/mL。

不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(n=3)

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3 結論

本研究采用單因素與正交試驗對銀耳菌糠黑色素微波輔助堿溶酸沉法的提取工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，其最佳提取工藝條件為料液比1∶40(g/mL)、提取堿液濃度1.75 mol/L、水解時間2 h和微波處理時間60 s，在此條件下所得黑色素粗提物的色價為156.6，純化后的黑色素色價達到316.0。本研究證實了此方法有助于銀耳菌糠黑色素提取純化，新增有效提取銀耳菌糠黑色素的方法，具有提取時間較短、能耗較低、溶劑消耗較低等優(yōu)點，在提取過程中也同樣表現(xiàn)出黑色素的不穩(wěn)定性，易改變黑色素的結構，從而影響黑色素的提取效果，同時，銀耳菌糠因培養(yǎng)基不同而不同，黑色素的提取工藝研究工作需更深入、更細致。

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Study on extraction process and antioxidant activity of melanin fromTremellafuciformisresidue

SHI Xuan1YANYu2LIANGXu-ming1TANHong-jun1YANGYong1ZHONGGeng2SHIWen-juan3

(1.ChongqingAcademyofChineseMateriaMedica,Chongqing400065,China; 2.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China;3.EnterpriseEngineeringResearchCenterforTremellaNutritionFood,Chongqing409000,China)

Melanin was extracted by alkali solution and acid extraction method with the assistance of microwave fromTremellafuciformisresidue. The separation and purification was optimized. The spectral characteristics and antioxidant activities of melanin were researched. The results showed that the optimum process of extracting melanin fromTremellafuciformisresidue by alkali solution and acid extraction method with the assistance of microwave were as follows: amount of extraction solvent to yield 1∶40，concentration of NaOH 1.75mol/L,hydrolyzing time 2 h,microwave treatment time 60 s,In this condition color value of melanin extracted from Tremella fuciformis residue was 156.6,and was 316.0 after purification.By spectroscopic,melanin from Tremella fuciformis residue was identified to be DOPA.The half clearance rates of DPPH radical and ·radical were 1.74,1.08mg/mL,respectively.

Tremellafuciformisresidue; melanin; microwave; separation and purification; spectral properties; antioxidant activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.035

重慶市基本科研業(yè)務費計劃項目(編號：2014cstc-jbky-01902)

師萱，女，重慶市中藥研究院助理研究員，碩士。

鐘耕(1964—)，男，西南大學教授，博士后。 E-mail：zhongdg@126.com

2016—08—17