李 光,柴文戍,康 健

阻塞性睡眠呼吸暫停 (obstructive sleep apnea,OSA)在西方國家是一種常見的疾病,其發(fā)病率在男性約為 4%,女性約為 2%[1]。OSA可引起行為和神經(jīng)精神障礙,包括日間嗜睡、短期記憶障礙及理解缺陷。不少研究表明,OSA患者存在氧化應(yīng)激,進(jìn)而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡增加,與患者的神經(jīng)功能損害有關(guān)[2]。褪黑素 (MEL)是松果體分泌的一種抗氧化劑,具有廣泛的抗氧化能力,外源性應(yīng)用褪黑素可對自由基起保護(hù)作用。因此,本研究選用間歇低氧 (intermittent hypoxia,IH)大鼠模型,模擬 OSA存在的缺氧/再復(fù)氧病理生理過程,同時應(yīng)用抗氧化劑褪黑素進(jìn)行干預(yù),觀察褪黑素能否通過增加抗氧化酶的表達(dá)來減輕間歇低氧誘導(dǎo)的海馬損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 為體質(zhì)量 200～230 g的清潔級雄性健康 SD大鼠 (中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供),共 30只。

1.2 主要儀器及試劑 間歇低氧造模設(shè)備 (Oxycycler Model A84XO;BioSpherix Instruments,Redfield,NY,USA),氧氣和氮?dú)?可見光分光光度計(jì),PCR循環(huán)儀 (Sigma 2002),紫外分析儀 (UV3l0,以色列),褪黑素 (美國 Sigma公司產(chǎn)品),超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),RT-PCR試劑盒 (Takara公司)。

1.3 間歇低氧大鼠模型的建立 雄性 SD大鼠置于間歇低氧設(shè)備(Oxycycler Model A84XO;BioSpherix Instruments,Redfield,NY,USA)中造模,使倉內(nèi)氧濃度變化于 5%～21%之間,每 8 min循環(huán) 1次,最低氧濃度為 5%,最高氧濃度為21%,共 2周 (每天 8∶00～16∶00),對照組 SD大鼠暴露于室內(nèi)空氣中。動物自由進(jìn)食飲水,動物室溫度控制在 22～24℃,相對濕度為 30%～40%,光照 12 h/d(8:00開燈,20:00關(guān)燈)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對照組 (CON組)、間歇低氧組 (IH組)、褪黑素治療組 (MEL組),每組10只,分籠飼養(yǎng)。褪黑素藥物使用方法為臨用前以無水乙醇溶解,再加 0.9%氯化鈉溶液配制,使乙醇濃度為 2%,置 4℃冰箱保存?zhèn)溆?褪黑素 (10 mg/kg)于每天間歇低氧實(shí)驗(yàn)前 30 min腹腔注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即將大鼠從間歇低氧設(shè)備中取出用于實(shí)驗(yàn),取出大鼠海馬組織,保存在 -80℃冰箱中備用。采用化學(xué)比色法測定海馬組織 MDA和 SOD水平,并采取 RT-PCR方法檢測海馬組織中銅/鋅超氧化物歧化酶 (Cu/ZnSOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx)、組織過氧化氫酶(CAT)的 mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析,p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬組織 MDA水平 CON組為 (1.28±0.03)μmol/g protein,IH組的 MDA水平為 (1.67±0.03)μmol/g protein,MEL組為 (1.39±0.02)μmol/g protein,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=533.334,p＜0.01);IH組的 MDA水平高于 CON組,褪黑素治療后 MEL組的 MDA水平低于 IH組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.01,見圖 1)。

2.2 各組大鼠海馬組織SOD水平 CON組為 (60.95±2.99)×103NU/g protein,IH組的 SOD水平為 (44.59±2.67) ×103NU/g protein,MEL組為 (58.24±3.22) ×103NU/g protein,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=87.068,p＜0.01);IH組的 SOD水平低于 CON組,褪黑素治療后 MEL組的 SOD水平高于 IH組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.01,見圖 2)。

2.3 各組大鼠海馬組織抗氧化酶 mRNA表達(dá)的水平 IH組抗氧化酶 Cu/ZnSOD、GPx、CAT的 mRNA水平比對照組明顯減少 (p＜0.01),MEL治療組抗氧化酶的 mRNA水平比 IH組明顯增高 (p＜0.01,見表1及圖 3)。

表 1 各組大鼠海馬組織抗氧化酶的平均 mRNA水平比較 Table 1 Comparison of mean mRNA levels of antioxidant enzymes in hippocampal tissues in the different groups of rats

表 1 各組大鼠海馬組織抗氧化酶的平均 mRNA水平比較 Table 1 Comparison of mean mRNA levels of antioxidant enzymes in hippocampal tissues in the different groups of rats

注:與 CON組比較,*p＜0.01;與 IH組比較,▲p＜0.01

組別 Cu/ZnSOD/β-actin GPx/β-actin CAT/β -actin CON組 0.49±0.03 0.54±0.04 0.56±0.03 IH組 0.22±0.03* 0.32±0.03* 0.37±0.03*MEL組 0.41±0.02▲ 0.53±0.03▲ 0.52±0.04▲F值.833 P值 0.000 0.000 0.000 328.691 135.733 95

圖 1 各組大鼠海馬組織 MDA水平比較Figur e 1 Comparison of MDA levels in hippocampal tissues in the different groups of rats

圖 2 各組大鼠海馬組織SOD水平比較Figur e 2 Comparison of SOD levels in hippocampal tissues in the different groups of rats

圖 3 各組大鼠海馬抗氧化酶的平均 mRNA水平比較Figur e 3 Comparison of mean mRNA levels of antioxidant enzymes in hippocampal tissues in the different groups of rats

3 討論

海馬在學(xué)習(xí)和記憶中起著重要作用,海馬組織是富含多不飽和脂肪酸的神經(jīng)組織結(jié)構(gòu),易受到自由基的攻擊而遭到損傷,即易受氧化應(yīng)激的損傷。OSA患者的海馬損傷可能與 IH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)。氧化應(yīng)激是 OSA的病理生理機(jī)制之一,可以導(dǎo)致神經(jīng)精神障礙[3-4]。本研究結(jié)果表明,在 IH組大鼠的海馬組織存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài),MDA水平升高,SOD水平降低,抗氧化酶的表達(dá)降低,說明 OSA患者存在的間歇缺氧狀態(tài)可能導(dǎo)致海馬組織的氧化應(yīng)激狀態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致海馬損傷。

褪黑素是一種自由基清除劑,具有廣譜抗氧化能力。由于具有高度的脂溶性,它可以自由通過血 -腦脊液屏障[5]。由于海馬組織含豐富的多聚不飽和脂肪酸并且具有相對較弱的抗氧化能力,使其容易受氧化應(yīng)激的攻擊,因此抗氧化劑褪黑素自由通過血 -腦脊液屏障的能力對其保護(hù)海馬組織的氧化應(yīng)激損傷具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素 (10 mg/kg)可以阻止間歇低氧時海馬組織 MDA水平的增高,并且降低 SOD的活性,這提示褪黑素可通過自由基清除和生物分子的抗氧化保護(hù)來減輕氧化應(yīng)激。盡管 MEL組 MDA水平未降低到對照組水平,但這反映本研究中間歇低氧實(shí)驗(yàn)所用的最低氧濃度(5%)比其他實(shí)驗(yàn) (10%)更低及大腦對間歇低氧的易感性。

抗氧化酶 SOD和 GPx在防御氧化應(yīng)激方面有重要作用。超氧陰離子被 SOD催化,H2O2被 GPx轉(zhuǎn)化成 H2O,CAT催化H2O2分子轉(zhuǎn)化成 H2O和 O2,在正常情況下,線粒體產(chǎn)生的活性氧自由基 (ROS)能被這些抗氧化酶清除,以保持抗氧化/促氧化的平衡,然而,這些酶的能力被迅速增高的促氧化產(chǎn)物所抵消[6]。另外,氧化應(yīng)激能調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性和表達(dá)[7-9]。本研究結(jié)果證實(shí)間歇低氧大鼠海馬組織抗氧化酶 mRNA的表達(dá)水平顯著降低。氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,抗氧化酶表達(dá)的下降是內(nèi)在機(jī)制之一。事實(shí)上,褪黑素能直接清除ROS,也能通過上調(diào)抗氧化酶進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激。褪黑素能使抗氧化酶在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)[10-11],這也被本研究結(jié)果所證實(shí)。因此,除了清除自由基,褪黑素也能誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá),減弱抗氧化/促氧化的不平衡。

總之,褪黑素能通過對抗氧化酶轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié) (即它的抗氧化特性),來減輕間歇低氧誘導(dǎo)的海馬損傷。這提示褪黑素可以用于防治間歇缺氧所致的神經(jīng)功能損害,為 OSA患者的神經(jīng)功能損害的防治提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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