文亦磊 歐海玲 賴燕燕 崔錦珠

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧市 530023，E-mail：wenyilei@aliyun.com；

論著·臨床研究

人表皮生長因子受體2、核因子-κB及血管內(nèi)皮生長因子在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義▲

文亦磊1歐海玲1賴燕燕2崔錦珠1

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧市 530023，E-mail：wenyilei@aliyun.com；

2 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，南寧市 530023)

目的 探討胃癌組織中人表皮生長因子受體2(HER-2)、核因子-κB(NF-κB)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)情況及其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(S-P法)檢測126例胃癌組織、54例正常胃黏膜組織中HER-2、NF-κB及VEGF蛋白表達(dá)情況，分析三者的相關(guān)性及其表達(dá)與胃癌臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果 (1)胃癌組織中HER-2高表達(dá)率為21.4%(27/126)，NF-κB及VEGF蛋白的陽性表達(dá)率分別為53.9%(68/126)、58.7%(74/126)，均明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.05)；(2)低分化胃癌組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標(biāo)本中HER-2蛋白高表達(dá)率較高(P<0.05)；低分化胃癌組、漿膜或漿膜外浸潤組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標(biāo)本中NF-κB蛋白陽性率較高(P<0.05)；漿膜或漿膜外浸潤組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標(biāo)本中VEGF蛋白陽性率較高(P<0.05)。(3)胃癌組織中HER-2與NF-κB、HER-2與VEGF、NF-κB與VEGF表達(dá)均呈正相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 胃癌組織中HER-2、NF-κB及VEGF的陽性表達(dá)增高。HER-2可激活NF-κB以影響胃癌的發(fā)展和預(yù)后，激活VEGF可促進(jìn)腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，三者的協(xié)同作用對于研究胃癌的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及分子靶向藥物治療有重要意義。

胃癌；人表皮生長因子受體2；核因子-κB；血管內(nèi)皮生長因子；免疫組織化學(xué)

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，其死亡率居全世界癌癥死亡率的第二位[1]。我國每年新增胃癌患者80萬人，每年死于胃癌的人數(shù)約16萬人，死亡率為25.16/10萬，無論是發(fā)病率還是死亡率胃癌均居惡性腫瘤的前列。大多數(shù)患者來院就診時，已處在進(jìn)展期或晚期，雖然可通過手術(shù)、放療、化療等措施進(jìn)行治療，但治療效果不理想。近年來，隨著分子生物學(xué)與病理學(xué)的交叉融合，對胃癌發(fā)病機(jī)制及治療的研究已經(jīng)達(dá)蛋白、基因水平。人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)基因擴(kuò)增可增強(qiáng)酪氨酸激酶活性，再通過對多條途徑的作用而影響細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[2]。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是信號傳導(dǎo)通路中重要的上游因子，主要在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮作用，NF-κB失調(diào)涉及腫瘤發(fā)生發(fā)展和耐藥[3]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖，促進(jìn)血管和淋巴管的生成，對腫瘤的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響[4]。本文采用免疫組化方法檢測HER-2、NF-κB和VEGF在胃癌組織中的表達(dá)情況，以了解三者之間的相關(guān)性及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，并探討三者影響胃癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年1月至2015年10月收治胃癌患者126例，獲取其手術(shù)切除并經(jīng)病理檢測證實(shí)為胃癌的蠟塊標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理類型均為腺癌，臨床及病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前進(jìn)行放療、化療者。其中男性71例，女性55例；年齡34～86歲，中位年齡57歲；58例腫瘤直徑<5 cm，68例腫瘤直徑≥5 cm；根據(jù)分化程度：高-中分化59例，低分化67例；浸潤深度為浸潤黏膜層、黏膜下層或肌層者44例，浸潤漿膜層或漿膜外者82例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者74例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例；臨床TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期75例。另選54例正常胃黏膜作為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：輕-中度慢性胃炎中的胃鏡活檢組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢測為不典型增生及腸上皮化生者。其中男性21例，女性23例；年齡29～80歲，中位年齡58歲。

1.2 主要試劑及檢測方法 鼠抗人HER-2、NF-κB 及VEGF單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)法采用S-P法。標(biāo)本使用10%甲醛溶液固定過夜，石蠟包埋后5 μm厚切片。選取1張常規(guī)采用蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色進(jìn)行病理診斷，另外3張進(jìn)行免疫組化檢測。切片常規(guī)脫蠟水化后，檸檬酸高壓修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，其余步驟按試劑盒說明進(jìn)行操作。用磷酸緩沖鹽溶液替代一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1 HER-2的判讀：采用Hofmann等[5]推薦的胃癌HER-2蛋白檢測評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性著色為棕黃色信號定位于細(xì)胞膜；無著色或<10%腫瘤細(xì)胞膜著色為0/陰性；≥10%腫瘤細(xì)胞呈微弱、不完整的細(xì)胞膜著色為+/陰性；≥10%腫瘤細(xì)胞呈弱至中等強(qiáng)度完整的細(xì)胞膜著色為2+/不確定；≥10%腫瘤細(xì)胞呈強(qiáng)的、完整的細(xì)胞膜著色為3+/陽性。其中0和+視為低表達(dá)，2+和3+視為高表達(dá)。

1.3.2 NF-κB和VEGF的判讀采用半定量法[6]：NF-κB陽性表達(dá)部位為胞質(zhì)和(或)胞核；VEGF陽性表達(dá)部位為胞質(zhì)。先根據(jù)細(xì)胞的染色范圍計(jì)分，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；再根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；最后根據(jù)兩者相加所得的總分進(jìn)行結(jié)果判讀：<3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用秩相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HER-2、NF-κB、VEGF在胃癌組織和正常胃黏膜中的表達(dá) 胃癌組織中HER-2呈高表達(dá)，NF-κB及VEGF均呈陽性表達(dá)，見圖1、圖2、圖3。胃癌組的HER-2高表達(dá)率、NF-κB及VEGF陽性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜組(P<0.05)，見表1。

圖1 胃癌中HER-2高表達(dá)(S-P染色，×200)圖2 胃癌中NF-κB的表達(dá)(S-P染色，×200) 圖3 胃癌中VEGF的表達(dá)(S-P染色，×200)

表1 兩組HER-2、NF-κB、VEGF陽性率比較(n)

2.2 HER-2、NF-κB、VEGF表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 低分化胃癌組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標(biāo)本中HER-2蛋白高表達(dá)率較高(P<0.05)；低分化胃癌組、漿膜或漿膜外浸潤組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標(biāo)本中NF-κB蛋白陽性率較高(P<0.05)；漿膜或漿膜外浸潤組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標(biāo)本中VEGF蛋白陽性率較高(P<0.05)。見表2。

表2 HER-2、NF-κB、VEGF表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組織中HER-2、NF-κB、VEGF表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 胃癌組織中HER-2與NF-κB呈正相關(guān)(r=0.288，P=0.01)，HER-2與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.202，P=0.02)，NF-κB與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.293，P=0.001)。

3 討 論

HER-2是表皮生長因子受體家族成員之一，能通過多種途徑參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。HER-2可以通過絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶兩種途徑分別上調(diào)周期素D1和環(huán)氧酶-1的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡并使細(xì)胞進(jìn)入永生狀態(tài)，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展階段發(fā)揮重要作用[7]。本實(shí)驗(yàn)中胃癌組織高表達(dá)HER-2蛋白(21.4%)，而正常組織無HER-2蛋白表達(dá)(0%)，進(jìn)一步證實(shí)HER-2基因激活為胃癌發(fā)生始動因素之一的觀點(diǎn)。另外，HER-2還可以增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-7、MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，本研究結(jié)果亦顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的HER-2高表達(dá)率(28.4%)高于無淋巴結(jié)表達(dá)病例(11.5%)(P<0.05)。有研究表明，HER-2基因的擴(kuò)增和過表達(dá)與較低的中位生存期及較差預(yù)后具有相關(guān)性[8-9]，而本實(shí)驗(yàn)中低分化胃癌病例和Ⅲ、Ⅳ期病例的HER-2高表達(dá)率分別高于高分化胃癌和Ⅰ、Ⅱ分期的病例(P<0.05)。這提示HER-2蛋白可能與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，表明HER-2基因可作為預(yù)測胃癌預(yù)后的指標(biāo)之一，并提示該基因的擴(kuò)增和過表達(dá)在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的多效核轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡等多種病理生理過程的基因調(diào)控。Makino等[10]的研究發(fā)現(xiàn)HER-2蛋白可以通過Pi3k-Akt途徑激活NF-κB的表達(dá)，被激活的NF-κB進(jìn)入胞核后可以通過以下方式抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生：(1)通過激活B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白發(fā)揮抗凋亡作用；(2)通過上調(diào)C-IAP的表達(dá)，從而抑制半胱天冬酶-8的活化，阻止凋亡的發(fā)生；(3)通過調(diào)控各種細(xì)胞因子的表達(dá)而間接抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中HER-2與NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)，與安杰等[11]的研究一致，這提示HER-2作為上游的調(diào)控因子，可激活NF-κB的表達(dá)，兩者發(fā)生協(xié)同效應(yīng)，從抗凋亡、細(xì)胞永生、腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移等方面共同促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在低分化胃癌組、漿膜或漿膜外浸潤組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標(biāo)本中NF-κB蛋白陽性率較高(P<0.05)，提示NF-κB與胃癌分化程度、浸潤深度和TNM分期有關(guān)，其作為一個核心調(diào)控位點(diǎn)，對腫瘤的發(fā)展、預(yù)后有重要的影響，也為后續(xù)胃癌的基因靶向治療研究提供了一個參考位點(diǎn)。

VEGF是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成因子之一，其本身不能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，但能通過刺激淋巴管、血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成在腫瘤生長和發(fā)展中起重要作用[12]，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF在漿膜或漿膜外浸潤組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標(biāo)本中VEGF蛋白陽性率較高(P<0.05)，提示VEGF蛋白與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，可能涉及的機(jī)制包括[13]：(1)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶和組織因子，促進(jìn)基底膜的降解，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供條件；(2)增強(qiáng)血管通透性，促進(jìn)血漿纖維蛋白外滲為其他細(xì)胞的遷移提供一個網(wǎng)絡(luò)支架；(3)能夠促進(jìn)癌旁血管、淋巴管的生成，利于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。VEGF可以被Akt途徑激活[4]，而HER-2及NF-κB正是Akt途徑的上游調(diào)控基因，因此HER-2與VEGF、NF-κB與VEGF均具有相關(guān)性(P<0.05)，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

雖然手術(shù)與化療使胃癌患者的生存率有所提高，但其預(yù)后仍不理想，特別是中晚期胃癌患者的5年生存率仍然很低。而通過分子靶向治療，可以針對性的抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖，從而有效控制腫瘤的發(fā)展、浸潤。聯(lián)合檢測HER-2、NF-κB、VEGF在胃癌組織中的表達(dá)，能為胃癌的分子靶向藥物治療提供客觀、科學(xué)的依據(jù)，同時這些指標(biāo)也可以作為判斷胃癌患者預(yù)后、篩選高危轉(zhuǎn)移患者的有效指標(biāo)。隨著對胃癌在分子水平發(fā)生發(fā)展的深入研究，逐步明確胃癌細(xì)胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的重要指標(biāo)或節(jié)點(diǎn)，針對這些重要指標(biāo)或節(jié)點(diǎn)的多靶點(diǎn)聯(lián)合治療理念的實(shí)現(xiàn)，胃癌治療將會進(jìn)入一個精確、高效的全新境界。

[1] Shah MA,Schwartz GK.Treatment of metastatic esophagus and gastric cancer[J].Semin Oncol.2004,31(4):574-587.

[2] Ignatiadis M,Desmedt C,Sotiriou C,et al.HER-2 as a target for breast cancer therapy[J].Clin Cancer Res,2009,15(6):1 848-1 852.

[3] 文亦磊,葉星江.核因子-κB及Bcl-2在胃癌組織中的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué),2014,35(11):1 705-1 707.

[4] 關(guān)潤年,周曉東.Akt介導(dǎo)VEGF信號通路在促進(jìn)胃癌淋巴管新生中的作用[J].世界華人消化雜志,2012,20(7):541-545.

[5] Hofmann M,Stoss O,Shi D,et al.Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer:results from a validation study[J].Histopathology,2008,52(7):797-805.

[6] Volm M,Koom?gi R,Mattern J.Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer [J].Int J Cancer,1997,74(1):64-68.

[7] Ménard S,Tagliabue E,Campiglio M,et al.Role of HER2 gene overexpression in breast carcinoma[J].J Cell Physiol,2000,182(2):150-162.

[8] 宋 巖,黃 鏡,王金萬.HER2/neu基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)與晚期胃癌患者預(yù)后的關(guān)系[J].癌癥,2010,29(1):76-81.

[9] Park DI,Yun JW,Park JH,et al.HER-2/neu amplification is an independent prognostic factor in gastric cancer [J].Dig Dis Sci,2006,51(8):1 371-1 379.

[10]Makino K,Day CP,Wang SC,et al.Upregulation of IKKalpfa/IKKbeta by integrin-linked kinase is required for HER-2/neu-induced NF-kappaB antiapoptotic pathway[J].Oncogene,2004,23(54):3 883-3 887.

[11]安 杰,郭建昇.HER-2/neu和NF-κBp65在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2010,18(6):1 168-1 171.

[12]Bertolini F,Marighetti P,Martin-Padural I,et al.Anti-VEGF and beyond:shaping a new generation of anti-angiogenic therapies for cancer[J].Drug Discov Today,2011,16(23/24):1 052-1 060.

[13]Paganetti H.Changes in tumor cell response due to prolonged dose delivery times in fractionated radiation therapy[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,63(3):892-900.

Expressions and clinical significance of human epidermal growth factor receptor-2,nuclear factor-κB and vascular endothelial growth factor in gastric carcinoma tissues

WENYi-lei1,OUHai-ling1,LAIYan-yan2,CUIJin-zhu1

(1DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530023,China;2DepartmentofGenetics,GuangxiMedicalCollege,Nanning530023,China)

Objective To investigate the expressions and clinical significance of human epidermal growth factor receptor-2(HER-2),nuclear factor-κB(NF-κB) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in gastric carcinoma tissues.Methods The expressions of HER-2,NF-κB and VEGF proteins were detected by immunohistochemistry(S-P method) in 126 gastric carcinoma tissues and 54 normal gastric mucosa tissues.The correlation of the three proteins,and the relationship of the protein expressions with clinical and pathological characteristics of gastric carcinoma were analyzed.Results ① In gastric carcinoma tissues,the overexpression rate of HER-2 was 21.4%(27/126),the positive expression rates of NF-κB and VEGF protein were 53.9%(68/126) and 58.7%(74/126) respectively,which were significantly higher than those in normal gastric mucosa(P<0.05).② The overexpression rates of HER-2 protein in gastric carcinoma specimens were higher in the poorly differentiated gastric carcinoma group,lymphatic metastasis group and TNM stage Ⅲ+Ⅳ group(P<0.05).The positive expression rates of NF-κB protein in gastric carcinoma specimens were higher in the poorly differentiated group,serosal or subserosal infiltration group and TNM stage Ⅲ+Ⅳ group(P<0.05).The positive expression rates of VEGF protein in gastric carcinoma specimens were higher in serosal or subserosal infiltration group，lymphatic metastasis group and TNM stage Ⅲ+Ⅳ group(P<0.05).③ In gastric carcinoma tissues,the expression of HER-2 positively correlated with the expression of NF-κB or VEGF,and positive correlation also existed between NF-κB and VEGF expressions(P<0.05).Conclusion The positive expressions of HER-2,NF-κB and VEGF increase in the gastric carcinoma tissues.HER-2 can activate NF- κB to affect the development and prognosis of gastric cancer,and activate VEGF to promote the growth and metastasis of tumor.The synergistic effect of HER-2,NF-κB and VEGF has a great significance in the study of signal transduction network and molecular-targeted drug therapy for gastric cancer. 【Key words】 Gastric carcinoma,Human epidermal growth factor receptor-2,Nuclear factor-κB,Vascular endothelial growth factor,Immunohistochemistry

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(LX2014175)

文亦磊(1982～)，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤病理的臨床、基礎(chǔ)研究及病理教學(xué)。

R 735.2

A

0253-4304(2016)01-0031-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.10

2015-11-07

2015-12-25)